柽柳离体无性繁殖研究

李雪晗 陆玉建，2，3

（1滨州学院生物与环境工程学院，山东 滨州 256603；2山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心，山东 滨州 256603；3山东省黄河三角洲生态脆弱带工程技术研究中心，山东 滨州 256603）

柽柳为柽柳科柽柳属灌木或小乔木，药用价值较高[1]。柽柳多分布于东部至西南部地区，不仅可以生长在严寒、干旱和多风沙等环境中，还极耐盐碱，是典型的盐生植物[2-3]。柽柳根部有根癌菌，不仅能够优化土壤结构，还可以增加土壤中的有机质[4-5]。合理种植柽柳既能有效提升盐碱地区的土地利用率，又能扩大荒漠化地区的绿化覆盖范围，对生态环境的改善具有重要作用[6-7]。传统的柽柳繁殖方式是扦插和播种，实践中柽柳生长速度慢，培养周期长，成苗率低，且易受地理环境和季节的限制，难以满足市场需求[8-10]。

植物组织培养技术以柽柳作为材料进行离体无性繁殖，观察和分析不同植物生长调节物质对柽柳不定芽和生根诱导的影响，筛选柽柳不定芽诱导和生根培养的最优条件，在此基础上进一步进行转基因或者诱变，实现生物性状的改良[11-12]，可促进柽柳快速繁殖。该技术不仅能够大幅度缩短培养周期，而且不受时空限制，弥补了柽柳传统繁殖方式的不足[13-14]。近年来，柽柳的组织培养技术已经在快速繁殖、短周期育种等方面取得了较大的进步，在严寒、干旱、多风沙和重盐碱等地区柽柳繁殖发挥了重要作用。目前柽柳的组织培养技术仍处于发展阶段，还具有较大的发展空间。本研究以柽柳嫩茎为材料，分析了不同植物激素对柽柳不定芽诱导以及生根的影响，以建立柽柳高频离体无性繁殖体系，为柽柳的规模化种植以及优良品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取春季和夏季生长优良的柽柳幼嫩茎段为材料。所有试验材料均取自滨州学院黄河三角洲生态研究中心植物园。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制根据前期预试验的结果，设计9 种柽柳不定芽诱导培养基，分别为C1，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；C2，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；C3，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA；C4，MS+0.50 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA；C5，MS+0.50 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA；C6，MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA；C7，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L IBA；C8，MS+1.00 mg/L 6-BA+0.50 mg/L IBA；C9，MS+1.50 mg/L 6-BA+0.50 mg/L IBA。设计9种柽柳生根培养基，分别为R1，MS；R2，MS+0.10 mg/L NAA；R3，MS+0.20 mg/L NAA；R4，MS+0.01 mg/L NAA；R5，MS+0.50 mg/L NAA；R6，1/2 MS；R7，1/2 MS+0.10 mg/L NAA；R8，1/2 MS+0.20 mg/L NAA；R9，1/2 MS+0.01 mg/L NAA。

配制方法：称取适量的MS或1/2 MS固体粉末，加蒸馏水充分搅拌，分别加入3%蔗糖和相应的植物生长调节剂。定容后调节溶液的pH 值至5.8，添加1%琼脂，分装，121 ℃高压灭菌20 min后冷却备用。

1.2.2 外植体的消毒选取生长优良且健康无病害的柽柳枝条作为外植体，将其切成适宜长度的茎段，放入烧杯中。先用流水冲洗30 min，洗衣粉浸泡1 h，再用流水冲洗干净。随后转入超净工作台中，使用70%乙醇消毒30 s，10%次氯酸钠处理10 min，消毒期间须轻轻摇晃烧杯，以达到最佳的消毒效果。消毒完成后依次弃去乙醇和次氯酸钠，使用无菌水反复冲洗5～6次，将外植体上残留的乙醇和次氯酸钠冲洗干净后即完成整个外植体的消毒。

1.2.3 不定芽的诱导在超净工作台中，将消毒后的柽柳外植体切去两端，去掉发黄的叶片和枝条。将茎段切为约5 cm 小段，竖直接种到上述9 种不定芽诱导培养基中，每瓶接种5～7个外植体，接种完成后灼烧瓶口，盖上封口膜，放入恒温培养箱中25 ℃光照培养，连续观察外植体的生长状态，30 d后进行数据统计，计算外植体不定芽诱导率，公式如下。

1.2.4 柽柳的生根培养将诱导产生的柽柳不定芽反复继代培养，待不定芽生长至5 cm 左右时，选取生长良好的不定芽分别接种到上述9种生根培养基中，放入恒温培养箱中25 ℃光照培养，连续观察不定芽诱导产生不定根的情况，30 d 后统计生根数并计算生根率，公式如下。

2 结果与分析

2.1 不定芽诱导

将柽柳外植体分别接种到C1—C9不定芽诱导培养基中，接种30 d后，统计和记录培养基中不定芽生长情况（表1）。试验结果表明，在C1培养基中，柽柳不定芽诱导率为86.15%，不定芽生长优良且数量繁多；在C2培养基中，柽柳不定芽诱导率为76.06%，不定芽生长较旺盛；在C3培养基中，柽柳不定芽诱导率为75.66%，虽生长情况较好，但芽量稍少；在C4培养基中，柽柳不定芽诱导率为79.71%，不定芽数目较多，但部分枝条枯萎；在C5培养基中，柽柳不定芽诱导率为75.70%，丛生芽和单芽混生，枯枝较多；在C6培养基中，柽柳不定芽诱导率约为80.50%，不定芽数目较多，但偏黄；在C7培养基中，柽柳不定芽诱导率为50.00%，不定芽生长稀疏，数量较少，且较为细弱；在C8培养基中，柽柳不定芽诱导率为66.67%，不定芽生长一般，同样较为细弱；在C9培养基中，柽柳不定芽诱导率为43.30%，不定芽生长稀疏，芽量也较少。在这9 种柽柳不定芽培养基中，C1培养基不定芽诱导率最高且诱导出的不定芽生长优良，较为健壮。因此，C1培养基可作为柽柳不定芽诱导最适培养基，用于后续柽柳不定芽的大量诱导和扩繁。

表1 柽柳的不定芽诱导情况

续表1 柽柳的不定芽诱导情况

2.2 生根培养

选取较绿的柽柳嫩芽接种到R1—R9培养基中进行生根诱导，30 d 后观察和统计生根数目并计算生根率（表2）。试验结果显示，在R1培养基中，柽柳不定芽的生根率为72.23%，但诱导产生的根较为细长且数量较少；在R2培养基中，柽柳不定芽的生根率为54.29%，诱导产生根的数量极少，长度也较短，部分苗存在干枯现象；在R3培养基中，柽柳不定芽的生根率约为63.33%，诱导产生根的数量相对较少，根的长度也较短，且幼苗生长比较缓慢；在R4培养基中，柽柳不定芽的生根率达到76.10%，培养基中生根情况与R1相似，诱导产生的不定根较为细长且数量不多；在R5培养基中，柽柳不定芽的生根率为69.28%，诱导产生不定根的数量相对较少，根的长度也较短且生长比较缓慢；在R6培养基中，柽柳不定芽的生根率达到97.22%，诱导产生的不定根数量较多，根系较发达，幼苗生长旺盛；在R7培养基中，柽柳不定芽的生根率为52.91%，诱导产生的根数量极少，长度极短，且幼苗的生长缓慢；在R8培养基中，柽柳不定芽的生根率和R7接近，不定根的诱导情况也较相似，诱导产生的根数量少，长度短，幼苗的生长情况不佳；在R9培养基中，柽柳不定芽的生根率为95.84%，和R6培养基中不定根的诱导率较接近，诱导产生的根数量多，生长迅速，幼苗的生长状况良好。由上可得，在这9种生根培养基中，R6培养基可作为最适宜的柽柳生根诱导培养基，用于柽柳不定芽的生根诱导，经30 d生根诱导，可获得大量的试管苗。

表2 柽柳的生根培养情况

2.3 离体再生

采取生长优良的柽柳枝条，用清水冲洗掉枝条表面的泥土，转至超净工作台中，在无菌条件下用70%乙醇和0.1%次氯酸钠进行消毒处理，消毒完毕后用无菌水反复冲洗5～6 次，用镊子和解剖刀将外植体切至5 cm 左右，接种到最适不定芽诱导培养基C1中诱导产生不定芽，每瓶接种5～7 个外植体，放入恒温培养箱中25 ℃光照培养。在最适培养基中，柽柳的茎段可诱导长出明显的不定芽，且随着培养时间的延长，不定芽数量逐渐增多。待培养约30 d 后，可观察到诱导产生的嫩芽粗壮且较密集（图1A）；选取嫩绿且生长良好的不定芽进行继代培养，不定芽继续生长，持续培养14 d 后，不定芽的数量明显增多。将不定芽转接入新培养基继续增殖培养，30 d 后可以看到明显的丛生芽（图1B）；将丛生芽进行第一次丛生芽继代培养，培养14 d 后，丛生芽继续增多，长势较好；接着再选取生长粗壮健康的丛生芽进行第二次继代培养，培养14 d 后，丛生芽生长旺盛。当柽柳的不定芽生长至5 cm 左右时，将诱导产生的不定芽在无菌条件下接种到生根最适培养基R6中诱导生根，经恒温培养箱25 ℃光照培养约30 d 后，可看到在柽柳不定芽的基部生长出了数量较多、长度适中的不定根，根系较发达，幼苗生长旺盛（图1C）。此后继续进行壮苗培养便可得到数目较多且生长良好的试管苗。

图1 柽柳不定芽诱导和生根培养

3 结论与讨论

本研究选用柽柳茎段为材料，对其进行不定芽诱导和离体再生培养，观察和统计外植体不定芽和生根诱导情况。研究发现，在所设计的9 种柽柳不定芽诱导培养基中，C1培养基不定芽诱导率最高，不定芽长势好且数量多。C1、C2和C3培养基中植物生长调节物质6-BA 的加入量为1.00 mg/L，NAA 的浓度分别为0.01、0.05 和0.10 mg/L；C4、C5和C6培养基中6-BA 浓度为0.50 mg/L；而在C7—C9培养基中则将植物调节生长物质NAA 更换为IAB。6-BA 和NAA 是柽柳不定芽诱导比较适宜的植物生长调节物质，这2 种植物生长调节物质最适浓度分别为1.00和0.01 mg/L，在此比例下，柽柳不定芽的分化效果较好。在试验所设计的9 种柽柳生根培养基中，R1—R5培养基均使用MS 作为基本培养基，其中R1培养基中没有添加生长素类植物生长调节物质，其他培养基均加入了一定量的NAA，浓度分别为0.10、0.20、0.01和0.50 mg/L；R6—R9培养基均使用1/2 MS作为基本培养基，其中R6培养基中没有添加生长素类植物生长调节物质，其他培养基同样添加了一定量的NAA，浓度分别为0.10、0.20和0.01 mg/L。结果表明，不定芽在R6和R9生根培养基中诱导产生不定根的效果较好，诱导产生的根健康粗壮，根系较发达，幼苗生长旺盛。由此可见，在柽柳不定芽生根过程中，适当减少植物生长调节物质的加入量，对于不定芽的生根有明显促进作用。因此，宜使用1/2 MS作为柽柳不定芽诱导生根的基本培养基，若要加入植物生长调节物质，最适宜的方案是在1/2 MS的基础上加入0.01 mg/L NAA。实践中，NAA 对柽柳不定芽生根的影响不大，很可能是因为内源生长素的含量已满足不定芽的生根需求。本研究通过分析影响柽柳不定芽诱导和生根培养的因素，建立了柽柳离体无性繁殖体系，为柽柳的规模化种植以及优良品种的选育提供参考。