棉花根际真菌中拮抗菌的筛选鉴定

于欣茹

（阜阳市农业科学院，安徽 阜阳 236065）

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）是由土壤传播的病原菌，可导致棉花黄萎病，常存在于寄主植物的维管束系统中，一般杀菌剂无法接触到病原体[1]。赤霉病由多种镰刀菌侵染引起，病原菌主要以菌丝体在寄主病残体或种子上越夏过冬，也可在土壤中营腐生生活过冬[2]。棉花与其根际真菌的共生关系使棉花获得对病原体的一定抗性，同时可改善其发育过程和提高产量，促进养分吸收和提高肥料使用效率。研究表明，木霉（Trichodermasp.）作为低成本、有效和环保的生物防治剂，可在各种病理系统中建立自己的位置，对土壤平衡的影响较小，且不会损害控制病原体的有益生物[3]。黑曲霉（Aspergillus niger）作为一种植物溶磷真菌，可用作潜在的生物肥料，能增加土壤磷酸盐对植物的生物有效性[4]。通过调整土壤微生物的生态，将生防菌株制成有机肥来创造良好的根际微生物环境，以达到防控土传病害的研究在当前备受关注。利用有益微生物防治植物病害是切实可行的策略之一，寻找环境中高效、多功能的生防微生物是目前棉花黄萎病及赤霉病等病害防治的发展方向之一。本试验从中棉所08 等6 个陆地棉品种的根际土壤中分离出真菌，并筛选出拮抗赤霉病菌和大丽轮枝菌，且对棉花种子安全性无影响的真菌，为提高生物防治真菌利用效率提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中棉所08、中棉所41、中植棉2、冀棉11、鲁棉研28 和鲁棉研21植株的根际土壤；病原菌株为赤霉病菌（Fusarium graminearum）F0609、大丽轮枝菌V1070；苏棉9号种子。

硫酸卡那霉素（Kanamycin），利福平（Rifampicin），Maker DL2000（TaKaRa公司），PCR相关试剂购自南京诺唯赞公司。

无菌操作台，高压蒸气灭菌锅，电泳仪（EPS601型），PCR仪，光学显微镜（南京江南永新），扫描电镜（日立S-3000N，日本Hitachi）。

1.2 试验方法

1.2.1 不同棉花品种根际真菌的分离刮取不同棉花品种根表附着的土壤，用无菌水制成悬浮液（1 g土壤溶于100 mL水中），摇匀静置取上清液，用梯度稀释法涂布在有硫酸卡那霉素（50 mg/L）和利福平（50 mg/L）的马铃薯琼脂培养基（Potato Glucose Agar，PDA）平板上，每个品种3次重复。选取合适的浓度（每皿30～300 个菌落）对菌落计数，根据平板上菌落的颜色、形态和大小等挑取不同单菌落，平板划线纯化后4 ℃保存。

1.2.2 根际真菌对赤霉病菌的拮抗作用用异步培养法于PDA 平板中心接种直径5 mm 赤霉病菌F0609 菌饼，28 ℃培养2 d 后，在距菌饼1 cm 处的四周接种分离得到的根际真菌，28 ℃恒温箱中培养，以不接种根际真菌为对照。当对照赤霉病菌F0609 长至培养皿边缘时，测量抑菌率。每菌株重复3次。

抑菌率（%）=1－处理病原菌的直径÷对照病原菌的直径×100。

1.2.3 根际真菌的鉴定将分离到的菌株在PDA平板上培养，显微镜下观察菌丝和孢子，参照《真菌鉴定手册》[5]进行形态学鉴定。

依据各品种根际真菌优势种群和抑菌率效果，提取抑菌率高的菌株基因组DNA 进行分子生物学鉴定。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增菌株的18S rDNA序列。

PCR反应体系：2×High Fidelity Mix12.5 μL引物（20 μmol/L）1.0 μL DNA模板1.0 μL超纯水9.5 μL总体积25.0 μL

PCR 反应条件：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

PCR 产物委托第三方公司南京擎科进行测序，将测序结果提交到NCBI 数据库并进行BLAST比对。

1.2.4 根际真菌对大丽轮枝菌V1070的拮抗作用鉴定将已鉴定的10 株真菌分别与大丽轮枝菌V1070 进行平板对峙试验，在PDA 平板上间隔3 cm接根际真菌和大丽轮枝菌V1070菌饼（直径5 mm），28 ℃培养5 d，每天观察记录抑菌率，选出抑菌率较高的真菌。

1.2.5 根际真菌对大丽轮枝菌V1070 菌丝的影响从对峙的平板上挑取大丽轮枝菌V1070和拮抗真菌间接近但不接触的菌丝，用光学显微镜和扫描电镜观察，以平板上单独生长的大丽轮枝菌V1070菌丝做对照。

1.2.6 根际真菌对种子发芽的安全性测验将黑曲霉An1 菌株于马铃薯琼脂培养液中培养（28 ℃，150 rpm）48 h，过滤除去黏连菌丝。用纯水将滤液稀释10倍浸泡苏棉9号种子8 h，对照组用无菌水浸泡。在灭菌的营养土和蛭石为1∶3 的基质中播种100粒，以露白5 mm作为发芽指标，3 d后开始计数发芽率和鲜重并拍照。

2 结果与分析

2.1 根际真菌对赤霉病菌F0609的拮抗作用

用十字交叉法计算抑菌率，结合形态学鉴定，发现不同棉花品种根际真菌中优势种群相同，对赤霉病菌F0609 有拮抗效果的大多数是曲霉属、青霉属和木霉属（图1）。其中，中棉所08 根际真菌的平均抑菌率为35.31%，中棉所41 为30.28%，中植棉2 号21.50%，鲁棉研28 为26.39%，鲁棉研21 为12.06%，冀棉11 为20.33%。即棉花根际土壤中存在对赤霉病菌F0609 有拮抗效果的土壤真菌，中棉所08和中棉所41中选取的菌株平均抑菌率较高。

图1 各品种棉花根际真菌拮抗赤霉菌F0609的分离

2.2 根际真菌测序及鉴定

选取拮抗赤霉病菌F0609效果好的10个根际真菌菌株，标号1—10（图2），提取18S rDNA送南京擎科公司测序。在BLAST上检索同源性（表1），10个拮抗真菌菌株包括5个属，其中曲霉属有5个，为优势种群，青霉属1个，木霉属1个，镰刀霉属2个，被孢霉属1个。

表1 10株根际真菌的18S rDNA部分序列分析

图2 菌液18S rDNA扩增产物凝胶电泳结果

2.3 根际真菌对大丽轮枝菌V1070的拮抗作用

将已鉴定的10 株真菌分别与大丽轮枝菌V1070 进行平板对峙试验，筛选出抑菌率较高的菌株4 株，分别为来自中棉所08 的黑曲霉An1、来自鲁棉研21 的棘孢木霉Tr1、来自鲁棉研21 的层出镰孢霉Fu1 和来自冀棉11 的高山被孢霉Mo1，分别与大丽轮枝菌V1070 在PDA 培养基上对峙培养，观察到4种根际真菌对大丽轮枝菌V1070有不同程度的拮抗效应（图3），其中，黑曲霉菌An1 和棘孢木霉Tr1对大丽轮枝菌V1070的抑制效应最强，An1对大丽轮枝菌V1070 的平均抑菌率达91%，Tr1 为87%，高山被孢霉Mo1 为76%，层出镰孢霉Fu1 抑制率为70%。这4 种真菌均有作为生物防治真菌应用的潜力。

图3 4种棉花根际真菌对大丽轮枝菌V1070的拮抗作用

2.4 根际真菌对大丽轮枝菌V1070菌丝的影响

用光学显微镜和扫描电镜观察平板上接近而不接触的菌丝。用光学显微镜可看到黑曲霉An1对大丽轮枝菌V1070造成不同程度的损伤，表现为菌丝变细长，褶皱变多，菌丝有孔洞和断裂，促进产孢，分生孢子变多（图4A）。用扫描电镜可以看到菌丝分支增多，各部位都有膨大迹象，内含物质露出，细胞质外泄变得透明卷曲，菌丝体呈念珠状且顶端细胞变形膨大，形成球状空泡（图4C）。说明黑曲霉An1在平板上通过影响大丽轮枝菌V1070的发育进程，从而产生竞争性抑制。

图4 An1与V1070对峙培养12 h后对菌丝和孢子形态的影响

2.5 黑曲霉An1对棉花种子发芽的影响

经黑曲霉An1处理的苏棉9号棉花种子5 d 后发芽率为55%，10 d后鲜重2.9 g/株，对照组5 d后发芽率54.6%，10 d 后鲜重2.3 g/株（图5），表明黑曲霉An1 处理对苏棉9号种子发芽及幼苗鲜重积累的影响均不明显。

图5 黑曲霉An1对种子发芽的影响

3 结论与讨论

相关研究表明，许多丝状真菌，例如里氏木霉（Trichoderma reesei），能分泌多种纤维素分解酶，可以抑制病源真菌的生长，破坏细胞新物质沉积，从而导致菌丝体从顶端破碎，内容物外泄，直至死亡[6]。从多种植物根际土壤可分离到对根癌农杆菌有明显抑制效果的黑曲霉[7]。新陆中37棉花根际土壤中筛选的4 株粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）、3 株高山被孢霉（Mortierella alpina）以及1 株球毛壳菌（Chaetomium globosum）对大丽轮枝菌均有一定的拮抗作用[8]。来源于土壤的菌株赭曲霉（Aspergillus ochraceus）AAM-1 对大肠埃希氏菌和白菜黑腐病菌显示较好的抑菌效果[9]。木霉和青霉混合施用使小麦纹枯病和赤霉病发病率明显降低[10]。黑曲霉孢子的代谢产物对青枯雷尔氏菌和软腐欧文氏菌有显著的拮抗活性[11]。健康棉株的内生真菌镰孢镰刀菌CEF559 对黄萎病有生物防治潜力，CEF559 可完全抑制大丽轮枝菌分生孢子的产生，温室研究中，CEF559 对青枯病的防治效果大于60%[12]。从凤凰木的根际土壤中分离的曲霉属真菌得到化合物，对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和近平滑念珠菌有抗菌活性[13]。大量具有生防潜力的根际微生物栖息在根表，能更好地定殖在植株根系，且安全无污染，同时可以避免类似化学药剂施用后病原菌产生的抗性问题[14]。

由于拮抗赤霉菌的真菌报道较少，因此先筛选抗赤霉菌的根际真菌，再筛选抗大丽轮枝菌的根际真菌。本研究从6个陆地棉品种（中棉所08、中棉所41、中植棉2、冀棉11、鲁棉研28 和鲁棉研21）的根际土壤中，分离出64 株对赤霉病菌F0609 具有抑制作用的真菌，选取10 株进行测序鉴定，其中黑曲霉An1、棘孢木霉Tr1、层出镰孢霉Fu1 和高山被孢霉Mo1，对大丽轮枝菌V1070 的抑制率分别为91%、87%、76%和70%。用扫描电镜观察拮抗真菌黑曲霉An1 对大丽轮枝菌V1070 菌丝的影响，发现黑曲霉An1使大丽轮枝菌V1070形态异常，孢子破裂，生长受到抑制。用黑曲霉An1 处理棉花的种子，发现其对棉花种子发芽率和鲜重无明显影响。下一步研究将围绕几种真菌的拮抗机制及具体生防应用展开，为提高生防菌的利用效率提供参考。