柳芽粗多糖超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性分析

■ 范露露 陈渝林 孙 旭 张 鹏* 王 超 刘青春

（1.沈阳工学院生命工程学院，辽宁抚顺 113122；2.辽宁农业职业技术学院，辽宁营口 115009；3.济南市畜牧技术推广站，山东济南 250306）

柳芽是柳杨科（Salicaceae）柳属（Salix）植物的嫩芽，又被称作柳子、清肠草，其中富含多种有效化学成分[1]。近年来，随着耐药菌株不断出现，我国畜牧饲料已经进入全面禁抗时代，畜牧养殖行业正在面临巨大挑战，因此“替抗”产品的研发具有现实意义。国内外学者研究表明，多糖类化合物具有促进免疫器官发育、提高屠宰性能、提高生产性能及畜禽产品品质等能力[2-4]，且多糖具有毒副作用小、无污染、易获得等优点[5]，因此多糖类化合物有望成为最佳“替抗”产品。垂柳具有极高的观赏价值，我国乃至全球均广泛种植，然而大部分柳树资源被浪费，因此充分开发柳树资源具有重要的社会和经济价值。多糖的化学结构复杂，因此对其提取具有一定难度，试验采用超声协同水提醇沉法提取柳芽粗多糖（crude polysaccharide of willow bud，CPW），是利用超声波产生振动及空化作用，快速高效提取柳芽内容物，且对多糖结构破性小，可避免降低其活性。试验筛选出CPW 最佳提取工艺，同时考察其体外抗氧化能力，为开发有价值的绿色饲料添加剂和绿色兽药提供参考。

1 材料与方法

1.1 药材

柳芽于2021年4月在沈阳工学院院内采摘，将新鲜的柳芽清洗干净，放置于培养皿中，置于烘干箱中80 ℃下烘干至恒重，再将干燥的柳芽研碎、过筛（筛孔0.5 mm）。用80%乙醇溶液在80 ℃条件下脱脂回流，乙醇液面高于固体1 cm 即可。固形物过滤干燥，得柳芽粉末，备用。

1.2 主要试剂与仪器

无水乙醇、乙醚、浓硫酸、葡萄糖、苯酚（均为国产分析纯），购自成都市科隆化学用品有限公司；DPPH（DPPH·）自由基清除能力试剂盒（A153-1-1）、抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒（A018-1-1）、羟自由基测试试剂盒（A052-1-1）、总抗氧化能力检测试剂盒（A015-1），均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

电子天平（型号为FA1004B）、可见分光光度仪（型号为7230G），购自上海佑科仪器仪表有限公司；台式离心机（型号为2-16KL）、恒温水浴锅（型号为DK-8D），购自上海精宏实验设备有限公司；热空气消毒箱（型号为GX30B），购自天津市泰斯特仪器有限公司；匀浆机（型号为KQ3200DE）、数控超声波清洗器（型号为KQ-500DE），购自昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发器（型号为RE-52A），购自上海亚荣生化仪器厂。

1.3 柳芽粗多糖的提取

参考江和栋等[6]的水醇提取工艺来提取CPW。准确称取1 g柳芽粉末，根据相应液料比加入纯化水，在不同超声功率下超声处理20 min。再根据相应水浴温度进行水浴浸提2 h。将粗多糖提取液加入3 倍体积无水乙醇离心（4 000 r/min，20 min），所得粗多糖用乙醚和无水乙醇交替清洗2 次，在干燥通风处自然风干，即得到CPW。

1.4 单因素试验

各考察条件水平为：液料比[70∶1、60∶1、50∶1、40∶1、30∶1（mL/g）]、水浴温度（40、50、60、70、80 ℃）、超声功率（275、330、385、440、495 W），研究其中一个影响因素时，将其他均设置为固定值（液料比70∶1 mL/g、水浴温度60 ℃、超声功率385 W）。

1.5 响应面优化试验

响应面优化试验参考单因素试验所得结果，通过分析各个影响因素水平对CPW 得率的影响，选定液料比、水浴温度、超声功率这三个试验因子为变量，通过Design-Expert 12.0 软件分别设计三因素三水平的Box-Behnken 响应面试验，拟合求得回归方程来优化CPW提取工艺。

1.6 葡萄糖标准曲线的制作

参照王振伟[7]的方法以配制好的0.1 mg/mL 葡萄糖溶液作为试验标准液，并绘制吸光度（Y）与浓度（X）的标准曲线，得到方程（1）：

Y=0.160 7X2+0.539 5X+0.059 3（R2=0.990 3）（1）

1.7 柳芽粗多糖提取率的计算

粗多糖含量按公式（2）计算：

式中：C多糖——所提取到柳芽粗多糖浓度；

V多糖——柳芽粗多糖溶液的体积；

M柳芽样品——所取的脱脂回流后所得柳芽粉末的质量。

1.8 柳芽粗多糖体外抗氧化活性研究

基于Feng 等[8]的方法，按照试剂盒操作规程测定不同浓度（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL）柳芽粗多糖对DPPH·的清除率，计算方法见公式（3）。同时考察不同浓度柳芽粗多糖对·OH、O2-·抑制率计算公式分别见公式（4）、公式（5），分别记录517、550、550 nm处吸光度值（A值）。试验重复3次。

式中：A测定——试验中测定组吸光度值；

A对照——对照组的吸光度值；

A空白——空白组的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

如图1所示，CPW 的提取率随液料比的增加呈现出正比例增长的趋势。考虑到成本问题与实际操作情况，选择70∶1（mL/g）的液料比较为合适。超声功率在275～495 W 时，CPW 得率呈现先升高后降低的趋势，在385 W 时CPW 提取率达到最高，因此超声功率应选385 W。此外，水浴温度在40～80 ℃的条件下，CPW 的得率先增后降，当温度为60 ℃时CPW 得率达到最大值，故选择60 ℃为CPW 的最佳提取温度。

图1 液料比、超声功率、水浴温度对CPW提取率的影响

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面优化试验结果及方差分析

根据响应面设计优化柳芽提取粗多糖的工艺。液料比、水浴温度、超声功率作为试验自变量，设计3 水平共计17 组试验，考察其对CPW 提取率的影响。响应面试验因素水平见表1，试验设计与结果见表2。

表1 响应面优化试验因素水平

表2 Box-Behnken试验设计与结果

通过回归分析所得二次多元回归方程（6）：

根据表3中的P值可以得出，在试验范围内，模型极具显著性(P<0.000 1)；液料比（A）对CPW 提取率影响极显著，超声功率（B）对CPW 提取率影响极显著，且液料比（A）与水浴温度（C）的二次项均表现为极显著影响。交互相中AB、BC对CPW 提取率也表现为极显著影响，而AC的交互作用不强。按照F值推断出3 个试验变量对CPW 得率影响程度的显著性顺次为A>B>C。

表3 方差分析

2.2.2 响应面分析及柳芽粗多糖得率最佳提取工艺的验证

由Design-Expert 12.0 软件对试验数据进行分析得出液料比、超声功率、水浴温度对CPW 提取率影响的响应面图见图2。由所拟合的方程得出，回归系数R2=0.990 4，说明此模型拟合程度良好；矫正决定系数R2Adj=0.978 0，数据分散程度小，表现出非常高的准确度和可靠性。CPW 的最佳提取工艺为液料比69.985∶1（mL/g），超声功率为440.404 W，水浴温度为56.5 ℃，考虑到试剂生产应用中的便捷性，将最佳提取工艺修正为液料比70∶1（mL/g），水浴温度56 ℃，超声功率440 W，所得多糖浓度（C）为0.094 3 mg/mL，带入公式（2）可计算出CPW的提取率为6.6%。

图2 不同因素对CPW提取率的交互作用

2.3 柳芽粗多糖体外抗氧化效果

由图3a可知，不同浓度CPW均可清除DPPH自由基，且随着浓度的不断增加，具有良好的剂量依赖关系，所得线性拟合方程为Y（DPPH·）=-61.033X2+128.79X+14.214，R²=0.991 8，推算出DPPH自由基清除率的IC50=0.283 4 mg/mL，由此得到CPW对DPPH·具有良好的清除能力，当CPW 浓度为1.00 mg/mL，其最大清除率达到82.3%，呈现良好的抗氧化活性。

图3 CPW和VC对DPPH·清除能力和对O2-·和·OH的抑制能力

由图3b 可知，O2-·清除率随着CPW 与VC 浓度的增加而呈现出线性关系增加，并展现出明显的剂量依赖关系。所得拟合方程为：Y（O2-·）=-46.045X2+90.306X+34.759，R²=0.994 5，推算出O2-·清除率IC50=0.149 1 mg/mL，由此可知CPW 具有抑制O2-·生成的能力，当CPW 浓度为1.00 mg/mL 其最大清除率达到79.21%，呈现良好的体外抗氧化能力。

由图3c可知，当不断升高VC与CPW溶液的浓度，CPW和VC对·OH清除率也随之增加，并展现出明显的剂量依赖关系。所得拟合方程为：Y（·OH）=-61.774X2+122.1X+25.808，R²=0.992 4，由此推算出·OH 清除率IC50=0.178 4 mg/mL，故CPW 能有效抑制·OH 的生成，当CPW 浓度为1.00 mg/mL 清除率最大为86.2%，呈现良好的体外抗氧化能力。

试验通过借助总抗氧化能力（T-AOC）测试盒测定0.001 mg/mL 的VC 和CPW，评价其总抗氧化能力。如表4 所示，CPW 平均总抗氧化能力为26.18 U/mg，VC 的总抗氧化能力为 119.3 U/mg。结果表明CPW具有良好的抗氧化能力。

3 讨论

垂柳柳芽为药食同源的中草药，富含大量的有效成分，但目前对其研究较少，因此优化CPW 的提取方法对柳芽资源开发具有现实意义。多糖的提取方法有很多种，如酶提取法、酸碱提取法、热水浸提法等。酸碱提取法会破坏多糖中连接单糖的糖苷键，从而导致多糖提取率降低；酶中含有一定量的蛋白质，运用酶提取法提取多糖会使多糖中蛋白质含量增加，降低多糖纯度；热水浸提法虽提取多糖的产量高，但提取效率较低[9-12]。故本试验采用超声协同水提醇沉法提取柳芽内的粗多糖，相比于其他提取方法，该方法对多糖结构破坏作用小，缩短了提取时间，且减少了提取过程中的损耗，提取条件更加温和，易于掌握，操作简单，提取过程高效、环保、噪音小，成本低廉，更适用于大规模提取多糖。张彦军等[13]研究发现，采用热水提取南瓜多糖的提取率为2.86%，碱法提取南瓜多糖的提取率为3.98%，而蒋高华等[14]采用超声提取南瓜多糖的提取率高达35.6%。刘晓鹏等[15]与张双奇等[16]都采用了超声协同水提醇沉法提取多糖（连钱草多糖提取率为4.95%～5.12%，天麻多糖提取率为5.3%），并取得了较好的效果。酚羟基是构成多糖类化合物的要成分之一，其含量丰富，且该物质具备有效清除自由基的能力，故对CPW 清除或抑制DPPH·、·OH 和O2-·的能力进行检测，以此衡量其体外抗氧化能力。试验结果表明，在抑制·OH 与O2·-的能力上，CPW（IC50：0.178 4 mg/mL，IC50：0.149 1 mg/mL）明显优于黄秋葵多糖（IC50：1.999 8 mg/mL，IC50：2.690 8 mg/mL）[17]。在清除DPPH·方面，CPW（IC50：0.283 4 mg/mL）相比于百香果果皮多糖（IC50：3.149 mg/mL）具有较好的清除能力，并且CPW（IC50：0.178 4 mg/mL）在抑制·OH的能力上也优于百香果果皮多糖（IC50：1.43 6 mg/mL）[18]。近年来，多糖渐渐被应用于动物养殖方面，并产生了较好的效果。吴占运[19]研究发现，在断奶仔猪日粮中适当添加黄芪多糖可提高仔猪的生产性能，降低仔猪腹泻率。

此外，多糖在家禽饲料中也扮演着重要角色，研究发现，在家禽饲料或饮水中添加适量的白术多糖、紫锥菊多糖、川麦冬多糖和枸杞粗多糖可增加禽类每日增重，提高机体免疫力，提高生产性能等[20-23]。本试验优化了CPW 提取工艺，为CPW 在畜牧养殖产业的应用奠定了基础。

4 结论

CPW 的最佳提取工艺：液料比70∶1（mL/g），水浴温度56 ℃，超声功率440 W。在最优提取条件下，CPW 提取率高达6.6%。抗氧化效果试验结果表明，CPW表现出良好的体外抗氧化能力。