用矿物元素指纹识别中华绒螯蟹产地及其养殖水体

宋学宏，黄芳，梁凤玲，胡建国，陆彬，蔡春芳

（1.苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215123；2.苏州市农产品质量安全监测中心，江苏 苏州 215104；3.苏州市阳澄湖大闸蟹行业协会，江苏 苏州 215137）

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis，以下简称河蟹）是我国重要的淡水养殖对象，2020 年全国产量达77.6 万t。江苏是河蟹的主产区，养殖产量（35.9 万t）接近全国产量的一半，形成了包括阳澄湖大闸蟹在内的多个知名品牌地理标志产品。河蟹以其特有的鲜甜滋味著称，不同产地的河蟹滋味各有特色[1]。为了保护生产者、经营者和消费者的利益，许多品牌的河蟹都配有防伪标识，像阳澄湖大闸蟹还用不同颜色的防伪标识来区分养殖水体是阳澄湖湖区（蓝色）还是周边池塘（绿色）。尽管如此，市售河蟹鱼目混珠现象仍较突出，大闸蟹被戏称“大杂蟹”。开发河蟹产地及养殖水体识别技术对河蟹产业的健康发展意义重大。

水生动物具有富集矿物元素的特点[2,3]，不同水体中矿物元素的种类和含量差异明显，这会影响到水生动物体内矿物元素指纹[4]。研究表明：用矿物元素指纹识别水生动物产地具有较高的准确率[5-8]。赵鉴等[9]、张政权等[10]报道元素指纹也可用于河蟹产地识别。但元素指纹可否用于同一地区不同养殖水体的河蟹的识别还鲜有研究。

水产养殖动物体内的矿物元素不仅可从养殖环境中富集，还来自人工饲料或饵料。在河蟹饲料中常添加充足的Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn、Cu 等矿物元素[11,12]。此外，河蟹生产管理中还常投入硫酸铜、硫酸锌等控制青苔与纤毛虫的生长[13,14]，这可能干扰以矿物元素指纹为依据的产地识别，而以往基于元素指纹的河蟹产地判别技术研究中，都纳入了上述部分元素[8-10]。剔除这些矿物元素对判别准确率的影响尚不清楚。

本研究通过比较江苏境内不同产区及养殖水体的河蟹体内矿物元素含量的差异，验证矿物元素指纹用于河蟹养殖产地和养殖水体识别的可行性，分析剔除了养殖中外源输入量较大的矿物元素后对判别准确率的影响，为河蟹产地和养殖水体识别技术开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及处理

2021 年10 月中旬,采集阳澄湖湖区（YCL）、阳澄湖周边池塘（YCP）以及洪泽湖（HZL）、高邮湖（GYL）、固城湖（GCL）湖区出产的河蟹。根据湖泊的大小及阳澄湖流域池塘分布情况确定采样位点数（表1）。鉴于河蟹对矿物元素的富集与性别不相关[15]且成蟹中雄蟹占比高，本研究仅以雄蟹为实验材料。从每个位点采集10 只附肢齐全、体质健壮的雄蟹样品，平均体质量如表1 所示。将采自同一位点的河蟹处死后合并粉碎，速冻，保存于-20 ℃冰箱备用。

表1 实验用中华绒螯蟹样品信息Tab.1 Sample information of Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis for experiment

1.2 矿物元素分析

从冰箱中取出样品，冷冻干燥，采用电感耦合等离子体质谱法（GB 5009.268）测定矿物元素。测定中，称取样品0.5 g（精确至0.001 g）于微波消解罐中，加入6 mL 硝酸（北京化学试剂研究所），先在石墨赶酸器（BHW-09C，海博通化学科技有限公司）上120 ℃预消解30 min，再采用微波消解仪（Mars6，美国CEM公司）进行消解。消解程序分3 步，每步升温时间均为5 min，控制温度分别为120 ℃、180 ℃、190 ℃，保温时间分别为6 min、10 min、15 min。冷却后取出，缓慢开盖排气，适当赶酸后，用超纯水定容至10 mL，混匀，上机测定。所用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）为美国Thermo Fisher 公司产品（iCAPQ），仪器工作条件为：采用动能歧视消除模式（KED），射频功率1 550 W，冷却气流速14 L/min，辅助气流速0.8 L/min，雾化气流速1.0 L/min，Q Cell 气体（He）4.5 mL/min，驻留时间0.02 s，扫描次数100次，进样时间45 s，蠕动泵转速45 r/min。点燃等离子体后，仪器预热30 min 至稳定，引入多元素混合调谐溶液调节ICP-MS 的各项参数，选择低中高质量数元素调谐ICP-MS 的灵敏度，同时调节氧化物以及双电荷等指标至满足测定要求。通过三通在线引入内标溶液，依次测定标准曲线、空白溶液和样品溶液。采用标准曲线定量法定量，使用扇贝生物成分分析标准物质作为全程质控样（检测结果均在允许误差范围内）。测定的元素有Ca、Mg、K、Na、Sr、Fe、Ba、Al、Ti、Mn、Zn、Cu、As、Cr、Ni、Se、V、Pb、Ce、Y、La、Co、Nd、Eu、Hg、Sb、Dy、Pr、Gd、Cd、Sm、Er、Yb、Lu 和Tm 共35 种，所用标样均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心。

1.3 数据处理

5 组河蟹体内矿物元素含量采用平均值±标准差表示，所用统计软件为SPSS19.0。采用单因子方差分析法对5 组河蟹体内矿物元素含量进行差异显著性检验，差异显著时（P＜0.05）进行邓肯氏多重比较。采用Fisher 判别分析法进行产地和养殖水体识别，其中自变量采用Wilks’lambda 步进法引入。先以全部35 种所测矿物元素作为自变量进行判别分析，在自变量集内剔除Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn和Cu 共8 种人为输入较大的矿物元素[11-14]同法运算，比较两者判别准确率的差异。

2 结果与分析

2.1 不同来源河蟹体内矿物元素含量均值比较

由表2 可见，除了Al、Cr 和V 外，其他32 种矿物元素组间都存在显著差异（P＜0.05）。其中，YCL 蟹的Ni 和Sb 显著高于其他3 个湖产的河蟹（P＜0.05），且YCP 蟹中含量也较高，而Eu 和Lu含量显著低于其他3 个湖产的河蟹（P＜0.05），且YCP 蟹中含量也较低。HZL 蟹的Sr 含量显著高于其他各组（P＜0.05），其次是GYL 蟹。GCL 蟹中Eu、Hg、Dy、Er、Yb、Lu 和Tm 均显著高于其他各组（P＜0.05，表2）。

表2 5 个来源的雄性中华绒螯蟹体内矿物元素含量(mg·kg-1)Tab.2 Contents of mineral elements in male Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins

2.2 基于矿物元素指纹的河蟹产地和养殖水体判别分析

以35 种矿物元素为自变量进行Fisher 判别分析，结果显示：Ca、K、Sr、Al、Zn、Cu、As、Y、Co 和Lu这10 种元素进入了判别模型。上述元素可以有效区分不同来源的河蟹，其中HZL 和GYL、YCL 和YCP 出产的河蟹在领域图上距离较近，其他3 个来源的河蟹距离较远（图1）。

图1 基于35 种元素对5 个来源中华绒螯蟹进行判别分析的领域图Fig.1 Canonical plot scores from discriminant analysis on Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 35 elements

对测试集样本判别准确率达98.3%，交叉验证正准确率98.3%（表3）。其中，对产自YCL、YCP、GYL 和GCL 的河蟹交叉验证准确率是100.0%。对产自HZL 的河蟹判别准确率为88.9%，有11.1%被判入GYL。

表3 基于35 种元素对5 个来源中华绒螯蟹判别分析的准确率Tab.3 Accuracy of discriminant analysis of Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 35 elements

剔除河蟹养殖过程中人为输入量较高的Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn 和Cu 8 种元素后，用余下的27 种元素再行判别分析，Sr、As、Pb、Y、Sb 和Lu 这6种元素进入判别分析模型，可区分不同来源的河蟹，且仍表现为HZL 和GYL、YCL 和YCP 出产的河蟹在图上距离较近（图2）。由表4 可见，对测试集样本判别准确率为100.0%，交叉验证总体准确率为96.7%。从误判情况看，产自HZL 的河蟹有11.1%被判入GYL，产自GCL 的河蟹有11.1%被判入GYL。

图2 基于27 种元素对5 个来源中华绒螯蟹判别分析的领域图Fig.2 Canonical plot scores from discriminant analysis on Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 27 elements

表4 基于27 种元素对5 个来源中华绒螯蟹判别分析的准确率Tab.4 Accuracy of discriminant analysis of Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis from 5 origins based on 27 elements

3 讨论

3.1 不同来源的河蟹体内矿物元素含量

不同水域环境影响养殖河蟹的矿物元素沉积。赵鉴等[9]以河蟹第三步足为材料比较了辽宁省盘锦、江苏省洪泽湖、江苏省兴化、湖北省梁子湖产的河蟹体内Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr、Ba 和Ti 共12 种元素含量，发现不同产地河蟹间Na、Mg、Al、K、Mn、Fe、Cu、Sr、Ba 和Ti 含量差异达到极显著水平（P＜0.01）。张政权等[10]分析了崇明、阳澄湖和兴化3 个地区河蟹肌肉组织中K、Ca、Na、Mg、Mn、Zn、Cu 和Fe 共8 种矿物元素的含量，发现所有元素均差异显著（P＜0.05）。本研究检测了5 个来源雄性河蟹全蟹样本的35 种元素，结果表明，32 种元素差异达显著水平（P＜0.05），与上述报道一致，表明不同产地河蟹体内矿物元素差异较大，可能与养殖水体内矿物元素差异有关[4]。

然而，本研究结果表明，同为阳澄湖地区，YCL出产的河蟹与YCP 出产的河蟹在24 种矿物元素上差异显著（P＜0.05，表2），提示这些元素受生产方式的影响较大。究其原因，可能与蟹塘的水草有关：河蟹养殖水体均栽种大量水草，水草对底泥和水体中矿物元素的吸附能力较强[16,17]。在湖泊内，水在不断流动，会使被水草吸收的矿物元素得到补充。而在池塘中，整个养殖周期中通常只是少量注水以补偿蒸发，因此水体中部分矿物元素浓度会因水草吸附而下降，这会影响到河蟹对水体中矿物元素的直接富集。同时，在池塘半封闭环境中，水草光合作用导致水体pH 较高[18]，而高pH 环境影响底泥矿物元素释放[19]以及水生植物对矿物元素的吸附[20]，这也会影响到河蟹对环境中矿物元素的富集。河蟹还会采食部分水草，水草对水体和底泥中的矿物元素富集效率越高，这些元素向河蟹体内转移效率也会越高。而池塘和湖泊水深差异较大，水草生长速度不同，影响草体中矿物元素的浓度。所有这些因素可能导致了YCL 和YCP 出产的河蟹体内矿物元素含量差异较大（表2）。因此，使得用元素指纹来识别同一地区池塘和湖泊出产的河蟹成为可能。

在阳澄湖地区的河蟹中Ni 和Sb 含量较高，而Eu 和Lu 含量较低。HZL 蟹中Sr 含量较高，与HZL地理距离较近的GYL 蟹中含量其次。这是否具有普遍意义还有待确认，或可成为河蟹产地鉴别的辅助证据。同理，GCL 蟹中Eu、Hg、Dy、Er、Yb、Lu 和Tm 均显著高于其他各组（P＜0.05，表2），也值得关注。

3.2 采用矿物元素指纹识别河蟹产地和养殖水体的可行性

矿物元素指纹已被应用于水产动物的溯源研究。郭利攀等[5]报道基于矿物元素指纹信息的产地判别技术可应用于近海3 个产地的4 种经济鱼类的产地判别。王紫晔等[6]发现，矿物元素可作为大西洋鲑（Salmo salar）的特征元素来表征其地理来源，而且基于矿物元素所建立的判别模型对大西洋鲑的整体及交叉验证判别准确率均高达98.8%。杨健等[7]报道，用体内元素的积累特征进行大银鱼（Protosalanx hyalocranius）产地判别具有较高的准确性。赵鉴等[9]报告基于矿物元素对盘锦、洪泽湖、兴化和梁子湖河蟹的判别准确率达100%。本研究结果表明，无论是否剔除养殖过程中人为输入量较大的元素，识别准确率均较高，与上述报道一致，表明元素指纹可用于河蟹产地识别。

由图1 和图2 可见，在判别分析领域图上YCL出产的河蟹和YCP 出产的河蟹距离最近，地理位置上较近的GYL和HZL出产的河蟹在领域图上分布也相对较近，这从侧面证明了元素指纹具有地域特点[21,22]，即河蟹体内元素指纹蕴含了产地信息。但这也决定了地理尺度较小时，判别准确率就会下降[8,23,24]。本研究中的河蟹均来自江苏境内，地理尺度较小，但两个模型中交叉验证判别准确率分别达98.3%和96.7%。YCP 蟹采自距离YCL 3 km 内的池塘，尽管这样，本研究2 个模型中YCP 和YCL 出产的河蟹判别准确率均达100%（表3，表4），表明元素指纹不仅可用于小尺度领域内河蟹产地的识别，对同一地区池塘和湖泊养殖的河蟹也能有效识别。

3.3 剔除养殖过程中人为输入量大的元素对河蟹来源识别的影响

河蟹饲料中常添加大量的Ca、Mg、K、Na、Fe、Mn、Zn 和Cu 等元素[11,12]，蟹塘水草管理和病害防控过程中还会输入铜和锌[13,14]，这可能会影响河蟹体内这些元素的含量。本研究结果表明，用全部35 种元素对5 个来源的河蟹进行判别时，11.1%的HZL出产的河蟹被判入了地理距离较近的GYL，其他产地的河蟹判别准确率均为100%（表3），暗示人为输入的矿物元素对判别准确率影响较小。剔除这8 种元素后的判别分析结果显示，除了仍有11.1%的HZL 出产的河蟹被判入GYL 外，还有11.1%的GCL出产的河蟹被判入地理距离较远的GYL，导致交叉验证准确率从98.3%降为96.7%（表4）。其原因可能是河蟹体内Ca、K、Cu、Zn 等元素受产地水土中含量的影响更大。判别模型能自动剔除不适用的变量，元素越多，变量筛选的余地越大，判别准确率也会越高。因此，在以元素指纹作为产地判别依据时，应尽可能增加检测元素的种类。

3.4 结论

可用矿物元素指纹识别河蟹产地和养殖水体。河蟹养殖过程中人为输入量较大的元素对产地和养殖方式识别准确率无负面影响。

致谢：苏州大学食品质量与安全专业2018 级汪旻卿、张禧腾、许戊江、张思宇等同学参与了部分研究工作，在此表示感谢！