鸢尾素调节Hippo/YAP信号通路对绝经后骨质疏松大鼠骨代谢的调节作用

侯秀秀, 刘 博, 邢宝瑞, 冯元超, 张亚弟, 石国君, 韩广普

(河北省沧州市中西医结合医院骨科, 河北 沧州 161001)

骨质疏松是骨科常见病慢性疾病之一,目前我国骨质疏松人数占全球50%左右,女性骨质疏松症的患病率是男性的数倍,其中老年女性绝经后骨质疏松(PMOP)占总发病人群的70%,严重影响患者身心健康[1]。目前主要采取服用雌激素、生长激素、降钙素等药物从预防骨质疏松基础矿化、抗骨吸收、促骨形成几方面进行治疗,但极易产生不良反应甚至产生耐药性,因此需要寻找更加安全高效的治疗药物是目前PMOP的研究重点[2]。目前已知鸢尾素是可以通过运动、饥饿、高温、药物等介导的肌肉产生与分泌的肌源性因子,具有调节能量代谢、糖脂稳态、骨骼健康状况等作用,常用于治疗肥胖、II型糖尿病、脂代谢和心血管疾病、骨代谢疾病等。研究显示,鸢尾素可以通过促进骨形成、抑制骨吸收增加骨量和骨密度,减轻骨质疏松症状,保护骨骼健康[3]。Hippo-YAP信号通路参与调节成骨代谢,激活Hippo-YAP信号通路可以促进成骨分化,加快骨形成及骨缺损重塑[4]。鸢尾素能否通过调控Hippo-YAP信号通路影响PMOP尚不清楚,本文主要探索鸢尾素对PMOP骨代谢及Hippo-YAP信号通路的影响,以期为PMOP的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1主要材料:200～220g SPF级雌性SD大鼠购于武汉云克隆动物有限公司(生产许可SCXK(鄂)2023-0021);鸢尾素(CM35)购于美国Novoprotein公司;维替泊芬(HY-Bol46)购于美国Med-ChemExpress公司;HE染色试剂盒(G11120)购于北京索莱宝公司;BALP(ARB12444)ELISA试剂盒购于北京百奥莱博公司;CBF-α1(GT04504B)ELISA试剂盒购于上海晶风生物公司;P1NP(NLR023)ELISA试剂盒购于武汉纽斯特生物公司;OC(JH-R30432)ELISA试剂盒购于上海继和生物公司;TAZ(ab307148)、YAP(ab76252)、p-YAP(ab76252)抗体购于上海Abcam公司。

1.2方 法

1.2.1构建绝经后骨质疏松大鼠模型:腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠,自腰椎沿背部正中线向下做纵行切口,分别从左、右侧卧位切除两侧卵巢,逐层缝合[5]。对照组只开腹腔暴露双侧卵巢,不摘除。术后8周检测造模大鼠与对照组大鼠骨密度,若造模大鼠骨密度比对照组显著下降,则证明PMOP大鼠造模成功。

1.2.2分组及处理:造模成功后,将所有实验大鼠分为对照组(Control组)、PMOP组、鸢尾素低、中、高剂量组(Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H组)[6]、鸢尾素高剂量+YAP抑制剂维替泊芬组(Irisin-H+VTPF组)[7],每组18只,共108只大鼠。Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H组:造模成功后,分别腹腔注射25、50、100 μg·kg-1·w·-1鸢尾素;Irisin-H+VTPF组:造模成功后,腹腔注射100 μg·kg-1·w·-1鸢尾素及10 mg·kg-1·d·-1VTPF;Control组与PMOP组腹腔注射与Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H组等量的生理盐水;连续给药4周。

1.2.3骨密度测定:给药结束后,各组随机选择6只大鼠剥离右侧股骨,并使用骨密度仪进行扫描,记录各组大鼠的BMD值。

1.2.4Micro-CT分析:将1.2.3各组大鼠的右侧股骨远端,用4%多聚甲醛固定后,4℃冰箱放置3d,生理盐水浸泡1d,Micro-CT扫描测量Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N、Tb.Sp。

1.2.5股骨组织形态学观察:从各组剩余大鼠中随机选择6只,剥离大鼠右侧股骨,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,沿冠状面切片,随后进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化,苏木精、伊红染色,显微镜下观察股骨组织形态学变化。

1.2.6BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平检测:剩余6只大鼠,戊巴比妥钠麻醉大鼠,尾静脉收集血样,室温静置30min,3000rpm离心15min,取上清,ELISA试剂盒检测BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平。

1.2.7TAZ、YAP、p-YAP蛋白检测:采血后断颈处死各组剩余的6只大鼠,迅速取出大鼠右侧股骨,冲洗干净,加入RIPA裂解液充分裂解,再将裂解液离心后取上清液,测定各组蛋白浓度。蛋白变性,根据蛋白量大小进行凝胶电泳、转膜、封闭,然后将膜与抗体TAZ、YAP、p-YAP、GAPDH 4℃孵育过夜,洗膜后加入二抗室温孵育,ECL暗室曝光,凝胶成像仪采集图像并分析蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1鸢尾素对各组大鼠骨密度的影响:与Control组比较,PMOP组大鼠BMD显著降低(P<0.05);与PMOP组比较,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H组大鼠BMD依次显著升高(P<0.05);与Irisin-H组比较,Irisin-H+VTPF组大鼠BMD显著降低(P<0.05);见表1。

表1 各组大鼠BMD比较

2.2鸢尾素对各组大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N、Tb.Sp的影响:与Control组比较,PMOP组大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N显著降低,Tb.Sp显著升高(P<0.05);与PMOP组比较,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H组大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N依次显著升高,Tb.Sp依次显著降低(P<0.05);与Irisin-H组比较,Irisin-H+VTPF组大鼠Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N显著降低,Tb.Sp显著升高(P<0.05);见图1、表2。

图1 各组大鼠Micro-CT图

表2 各组大鼠Tb.Th Tb.Ar Tb.N Tb.Sp比较

2.3鸢尾素对各组大鼠股骨组织形态学变化的影响:Control组大鼠股骨组织的骨小梁结构完整且排列有序;与Control组比较,PMOP组大鼠股骨组织的骨小梁结构紊乱,骨小梁厚度变薄,空骨陷窝明显,甚至发生轻微骨折;与PMOP组比较,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H组大鼠股骨组织骨小梁结构逐渐排列有序,空骨陷窝减少,股骨组织损伤逐渐减轻;与Irisin-H组比较,Irisin-H+VTPF组大鼠股骨组织的骨小梁结构紊乱,空骨陷窝明显增加,股骨组织损伤加重;见图2。

图2 HE染色观察各组大鼠股骨组织形态学变化(×400)

2.4鸢尾素对各组大鼠骨代谢的影响:与Control组比较,PMOP组大鼠血清BALP、P1NP、OC、CBF-α1显著降低(P<0.05);与PMOP组比较,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H组大鼠BALP、P1NP、OC、CBF-α1依次显著升高(P<0.05);与Irisin-H组比较,Irisin-H+VTPF组大鼠BALP、P1NP、OC、CBF-α1显著降低(P<0.05);见表3。

表3 各组大鼠血清BALP PⅠNP OC CBF-α1水平比较

2.5鸢尾素对Hippo-YAP信号通路的影响:与Control组比较,PMOP组大鼠TAZ、YAP、p-YAP蛋白表达显著降低(P<0.05);与PMOP组比较,Irisin-L、Irisin-M、Irisin-H组大鼠TAZ、YAP、p-YAP蛋白表达依次显著升高(P<0.05);与Irisin-H组比较,Irisin-H+VTPF组大鼠TAZ、YAP、p-YAP蛋白表达显著降低(P<0.05);见图3、表4。

图3 Western blot检测TAZ、YAP、p-YAP蛋白表达

表4 各组大鼠TAZ YAP p-YAP蛋白表达比较

3 讨 论

PMOP是一种卵巢激素缺乏引起的骨质疏松症,也是最常见的与年龄相关的骨质流失原因,常发生于女性绝经后的5～10年,其发病主要是由于女性进入围绝经期,卵巢功能下降,雌激素分泌急剧下降,致使破骨细胞介导的骨吸收速度加快,骨吸收与骨形成平衡被打破,加快骨转换,导致骨量减少、骨组织细微结构遭到破坏,进而促使骨脆性和骨折危险性大幅度提升,严重影响患者的生活质量和身体健康[8]。又由于之前服用的激素类药物副作用大且极易产生耐药性,所以寻求新的治疗药物至关重要。

鸢尾素作为骨骼肌分泌的肌因子,广泛分布于人体各组织,参与调控骨骼相关基因的表达,可以促进骨细胞的增殖,进而增大骨密度、韧性及强度。研究显示,鸢尾素可以直接靶向成骨细胞,促进成骨细胞增殖,还可以作用于破骨细胞祖细胞,增加骨分化,促进骨吸收,进而刺激骨重塑[9]。鸢尾素可以上调BMD、Tb.Th,抑制破骨细胞生成,促进成骨细胞增加,参与调控骨代谢以防治骨质疏松[10]。本文研究显示,鸢尾素可以改善PMOP大鼠股骨组织损伤,上调BMD、Tb.Th、Tb.Ar、Tb.N,下调Tb.Sp,说明鸢尾素可以通过促进骨形成,防治绝经后骨质疏松。

骨是人体重要的生物力学和生理学组织,由成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收共同作用的骨代谢是骨骼系统发展的重要环节。BALP是一种下丘脑分泌活性因子,介导破骨细胞,影响骨吸收,还诱导成骨细胞的形成,增加骨密度,提高骨强度。P1NP是骨形成初期的敏感指标之一。OC是由成骨细胞分泌,其表达高低可以反映成骨细胞的活性和功能变化。CBF-α1促进成骨细胞分化及成骨细胞的活性。研究显示,升高BALP、PⅠNP、OC、CBF-α1水平,有利于骨代谢过程中的骨形成,改善去卵巢骨质疏松大鼠骨髓微环境[11]。本文研究显示,PMOP大鼠体内的BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平下调,而鸢尾素可以上调BALP、P1NP、OC、CBF-α1水平,说明鸢尾素可以通过调控骨代谢参与骨形成与骨吸收过程。

Hippo-YAP信号通路参与器官生成、组织稳态、修复和再生、细胞代谢、肿瘤发生等多种过程,还可参与骨代谢,进而影响骨细胞增殖、分化、凋亡和存活[12]。TAZ和YAP是Hippo信号通路的关键效应物,当Hippo信号通路被激活,导致TAZ和YAP磷酸化,而磷酸化的TAZ和YAP随后可被隔离在细胞质中降解[13]。研究显示,激活Hippo-YAP信号通路可以促进成骨细胞的增殖和分化,有助于防治骨质疏松[14]。本文研究显示,鸢尾素可以上调TAZ、YAP、p-YAP蛋白表达,而YAP抑制剂VTPF可以部分逆转鸢尾素对成骨细胞的增殖和分化的促进作用,说明鸢尾素可以通过激活Hippo-YAP信号通路,改善绝经后骨质疏松症状。

综上所述,鸢尾素可以通过激活Hippo-YAP信号通路,参与调控绝经后骨质疏松的骨代谢。本研究仍存在局限性,鸢尾素可能通过调控其他信号通路影响骨代谢,且鸢尾素对Hippo-YAP信号通路的作用机制尚不明确,需要进行进一步实验验证。