十精丸对光老化大鼠皮肤LCs及炎症因子水平影响的研究

孙在峥 曹惠妍 马伟 陈丽娟

[摘要]目的：探討十精丸对于光老化大鼠皮肤朗格汉斯细胞（Langerhans cell，LCs）及体内炎症因子水平的影响。方法：SD大鼠，雌性50只，随机分为模型组、阳性对照组、十精丸低剂量组、十精丸中剂量组、十精丸高剂量组，每组10只。建立皮肤光老化模型，同时给予十精丸干预治疗。实验结束后，通过免疫组化法对大鼠皮肤LCs数量及形态进行观察，病理切片观察皮肤炎性浸润程度，ELISA方法检测皮肤组织和血清中白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。结果：免疫组化结果显示，与模型组相比，十精丸各剂量组表皮LCs细胞数目均有所增加，胞体形态改善，树突结构形成增多，细胞间连接紧密。其中十精丸高剂量组改善效果较为显著。病理切片结果显示，十精丸各剂量组大鼠皮肤炎性细胞浸润程度有所改善，十精丸高剂量组改善程度较为明显。ELISA检测结果显示，十精丸各剂量组皮肤组织匀浆及血清中炎症因子IL-6、TNF-α含量均有所下降。其中十精丸中、高剂量组下降明显，差异有统计学意义（P＜0.01），与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：十精丸能增加光老化大鼠皮肤组织中LCs细胞数量，改善LCs细胞异常形态，减轻大鼠皮肤组织的炎性细胞浸润程度，降低大鼠皮肤组织及血清中炎症因子IL-6、TNF-α的含量，表明十精丸能提高皮肤免疫功能，抑制炎症因子，从而修复皮肤功能，改善皮肤衰老状态。

[关键词]十精丸；皮肤免疫；光老化；朗格汉斯细胞；炎症因子

[中图分类号]R285.5    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）02-0051-05

Study on the Effect of Shijingwan on LCs and Inflammatory Factors

in Photoaging Rats

SUN Zaizheng1，CAO Huiyan2，MA Wei2，CHEN Lijuan3

（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150006，Heilongjiang，China; 2.College of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，Heilongjiang，China; 3.Jiamusi College of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Jiamusi 154000，Heilongjiang，China）

Abstract： Objective  To investigate the effects of Shijingwan on the levels of skin Langerhans cells （LCs） and inflammatory cytokines in photoaged rats. Methods  50 female SD rats were randomly divided into model group， positive control group， Shijingwan low-dose group， Shijingwan medium-dose group and Shijingwan high-dose group， with 10 rats in each group. The skin photoaging model was established， and Shijingwan were given for intervention. After the experiment， the amount and morphology of LCs in the skin of rats were observed by immunohistochemistry， the degree of inflammatory infiltration was observed by pathological sections， and the contents of Interleukin-6 （IL-6） and Tumor necrosis factor-α（TNF-α） in the skin tissue and serum were detected by ELISA. Results  Immunohistochemical results showed that， compared with model group， the number of epidermal LCs cells in each dose group of Shijingwan increased， the morphology of cell bodies improved， the formation of dendritic structure increased， and the connections between cells were tight. The improvement effect of Shijingwan high dose group was more significant. Pathological section results showed that the degree of skin inflammatory cell infiltration was improved in each dose group of Shijingwan， and the degree of improvement was more obvious in the high dose group of Shijingwan. ELISA results showed that the contents of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α in skin homogenate and serum of Shijingwan were decreased in each dose group. There was significant decrease in the medium and high dose groups of Shijingwan， with statistical significance （P＜0.01）， but no significant difference compared with positive control group （P＞0.05）. Conclusion  Shijingwan can increase the number of LCs cells in the skin tissue of photoaging rats， improve the abnormal morphology of LCs cells， reduce the degree of inflammatory cell infiltration in the skin tissue of rats， and reduce the contents of inflammatory factors IL-6 and TNF-α in the skin tissue and serum of rats， indicating that Shijingwan can improve the skin immune function， inhibit inflammatory factors， and repair the skin function. Improve skin aging.

Key words： Shijingwan; skin immunity; photoaging; langerhans cells; inflammatory cytokines

皮肤是人体防御疾病的第一道屏障，也是人体美的重要载体。皮肤的老化不但影响外貌的美观，而且会增加皮肤疾病产生的概率。皮肤老化一般可分为内源性老化和外源性老化两种。皮肤光老化是外源性老化中最常见的类型，主要由紫外线过多照射引起，表现为皮肤干燥、松弛、皱纹、色素增加或脱失以及毛细血管扩张等，严重者导致皮肤表面隆起、开放性粉刺、光化性紫癜及表皮真皮增厚等表现[1]。因此寻找有效防治皮肤光老化的方法与手段，也是该领域研究的重点与难点。随着现代医学发展，中药用于抗光老化的研究取得了一定进展。近年来，有关中医药通过清除自由基、提高抗氧化酶活性、抑制炎症反应、调节免疫、修复胶原等方面防治皮肤光老化的研究越来越多，但其深入机制和复方成分的研究仍然尚少。现代医学与中医学理论相结合，发挥中药的独特作用是未来研究的重要方向[2]。

十精丸出自明代《普济方》，为驻颜防衰、延年益寿的经典方，由枸杞、熟地、山茱萸、肉苁蓉、菟丝子等十味药物组成。从组方上看，有阴阳并补、补而不腻的特点，从功用上看，有滋肾填精，补气养元，驻颜防衰之功。前期实验结果表明十精丸具有提高超氧化歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平，增加皮肤羟脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）含量以改善皮肤光老化的效果。本实验基于光老化的免疫抑制与炎症反应机制，探讨十精丸对大鼠光老化皮肤细胞免疫功能及炎症因子水平的影响，进一步丰富十精丸延衰驻颜理论的论证体系，对皮肤美容医学理论研究以及促进《普济方》中补虚延衰类中药复方的研发都具有积极的意义。

1  材料和方法

1.1 实验动物：雌性SD大鼠50只，月龄14～16个月，体重（450±100）g，购自哈爾滨医科大学实验动物学部，许可证号：SCXK（黑）2019-001。所有大鼠适应性饲养7 d，自由进食和饮水，饲养环境温度23℃～26℃，湿度20%～30%，保持饲料及饮水洁净充沛。所有实验程序和实验动物使用均符合黑龙江中医药大学实验动物伦理规定。

1.2 药物和试剂

1.2.1 药物：十精丸各剂量组包括枸杞、熟地、山茱萸、菟丝子、肉苁蓉等十味中药饮片，购自黑龙江中医药大学佳木斯学院附属医院中药局。阳性对照组包括维生素E软胶囊（大连水产药业有限公司，批号：国药准字H21021557）。

1.2.2 试剂：大鼠白介素6（IL-6）、大鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，生产批号20230323）、大鼠CD1a多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号20230320），苏木素伊红染色液、乙醚、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、二甲苯、4%中性甲醛、生理盐水、PBS缓释液、酸性乙醇分化液、柠檬酸盐溶液、去离子H2O2溶液、DAB显色剂、脱毛膏均为市售试剂。

1.3 主要实验仪器：SS-03AB型紫外线光疗仪（上海Sigma公司）；紫外线辐照计（北京师范大学光电仪器厂）；TGL-16G-C高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；酶标仪Thermo Fisher Scientific Oy（美国赛默飞）；DY89-I电动玻璃匀浆机（上海民仪电子有限公司）；Resecarch UVUF型超纯水制备系统（上海和泰仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 分组与造模

1.4.1.1 分组：实验动物适应性饲养7 d，随机分为5组，每组10只，即模型组、阳性对照组、十精丸低剂量组、十精丸中剂量组、十精丸高剂量组。

1.4.1.2 造模：以老龄大鼠结合紫外线照射诱导皮肤光老化模型，造模方式参考文献[3]。各组大鼠背部进行脱毛处理，剃毛区域面积大约为5 cm×5 cm。以自制固定器固定于光疗仪（UVA+UVB）下约40 cm处。每次照射剂量UVA约为29 J/cm2，UVB约为64 mJ/cm2，每次照射时间2 h，时间持续4周。造模过程中若出现皮肤水疱、溃烂情况，立即停止照射，待2～3 d皮损症状缓解后，再继续进行照射。照射后，大鼠出现皮肤进行性弹性丧失、皱纹增粗加深，伴有脱屑等光老化表现，病理检查示表皮结构不完整，真皮组织排列紊乱、分布不均匀为造模成功。

1.4.2 药物制备及用药：按十精丸原方药物组成及药量（十味各等分，共200 g），精选道地药材，去除杂质，制备水煎液。经过浓缩后，分别得到所含生药浓度为1.0 g/ml的十精丸低剂量组药液，生药浓度为2.0 g/ml的中剂量组药液，生药浓度为4.0 g/ml的高剂量组药液。置于4℃冰箱保存，使用前水浴加热至30℃。每日光照结束后，根据人与大鼠用药剂量换算，十精丸各剂量组灌胃给药，时间为4周。同时阳性对照组及模型组分别给予同等容积的维生素E溶液及0.9%生理盐水灌胃。

1.4.3 标本采集与制备

1.4.3.1 血清样本制备：最后一次灌胃结束后，大鼠禁食不禁水12 h，乙醚吸入麻醉后，腹主动脉采血4～5 ml，静置1 h，于4℃离心机内，3 500 r/min，离心15 min，取上清液，于-80℃保存待检。

1.4.3.2 皮肤组织匀浆制备：于大鼠背部区域剪取1 cm×1 cm面积皮肤组织，预冷生理盐水中漂洗3次，以滤纸拭干水分后，用眼科剪剪碎组织，置于匀浆管中，以样本质量︰稀释液体积为1∶9的比例加入预冷PBS缓释液。放入匀浆机中经充分匀浆后，将匀浆液以2 000 r/min的速率，低温离心15 min，取上清液待检。

1.4.3.3 皮肤病理切片制备：背部脱毛区域剪取约1 cm×1 cm大小的皮肤组织，去除脂肪与结缔组织，预冷生理盐水冲洗3次，以4%中性甲醛溶液固定保存。经酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片（5μm）。

1.5 检测指标

1.5.1 LCs数量及形态观察：将大鼠皮肤组织切片经脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、展片、烤片、二甲苯和乙醇脱蜡至水，蒸馏水、PBS各漂洗3次（3 min/次），滴加去离子H2O2，室温孵育20 min，PBS漂洗后进行微波修复，PBS漂洗，滴加大鼠CD1a多克隆抗体，室温孵育2 h，PBS漂洗，滴加二抗，室温孵育20 min，PBS漂洗，滴加DAB显色剂显色，蒸馏水彻底冲洗终止反应，苏木素复染细胞核，乙醇和二甲苯脱水并透明，中性树胶封片后，光镜下观察并采集分析图片，观察LCs数量及形态变化。

1.5.2 皮肤组织炎性浸润程度观察：将大鼠皮肤组织切片经苏木素-伊红染色，光镜下观察炎细胞增殖及浸润程度。

1.5.3 IL-6、TNF-α含量检测：根据ELISA试剂盒说明书，按照指示在酶标仪上进行操作，分别对大鼠皮肤组织匀浆及血清IL-6、TNF-α含量进行检测。

1.6 细胞计数：光镜下对CD1a阳性LCs进行计数，阳性结果判断标准为：①细胞位于表皮层。②细胞膜和（或）细胞浆有棕黄色颗粒着色。在高倍显微镜10×20下随机选取5～10个不连续的视野，人工计数每个视野内阳性细胞的数量，每个标本阳性细胞数=（视野1阳性细胞数+视野2阳性细胞数+……+视野N阳性细胞数）/N，其中N为所选取的视野数。

1.7 统计学分析：实验数据采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，计量资料以（x¯±s）的形式表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 LCs数量及形态观察：结果显示，模型组LCs在表皮及真皮中呈散在性分布，表皮LCs数量少，胞体形态不规则，可见部分胞體萎缩，缺乏树突结构形成，与角质细胞之间的连接松散。与模型组相比，十精丸各剂量组表皮LCs数量均有所增加，胞体异常形态有改善。其中，十精丸高剂量组表皮LCs数量显著增加，胞体形态较为规则，树突结构形成增加，细胞之间连接较为紧密。十精丸高剂量组LCs数量高于模型组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；而与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1。

2.2 大鼠皮肤组织病理学观察：结果显示，模型组皮肤组织中有大量炎性细胞浸润，皮肤组织表皮厚薄不均，腺体增生较明显。十精丸各剂量组表皮厚薄较为均匀，腺体增生及炎性细胞浸润程度较模型组相比有所减轻；其中十精丸高剂量组与模型组相比，浸润的炎性细胞数量明显减少，炎性浸润程度有显著改善，腺体增生不明显，差异明显。与阳性对照组无明显差异。见图2。

2.3 IL-6、TNF-α含量的影响

2.3.1 大鼠皮肤组织匀浆中IL-6、TNF-α含量的影响：结果显示，与模型组相比，十精丸各剂量组皮肤组织匀浆中炎性因子IL-6、TNF-α含量均有所下降，其中十精丸中、高剂量组下降明显；有统计学意义（P＜0.01）。十精丸中、高剂量组与阳性对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3.2 大鼠血清中IL-6、TNF-α含量的影响：结果显示，与模型组相比，十精丸各组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均有所下降，其中十精丸中、高剂量组下降程度明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。十精丸中、高剂量组与阳性对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3  讨论

免疫抑制与炎症反应是紫外线致使皮肤光老化产生的机制之一。根据文献报道，紫外线通过抑制朗格汉斯细胞（LCs）、树突状细胞的免疫功能，改变体液免疫细胞因子的水平，从而对皮肤免疫系统造成抑制，引起皮肤组织中金属基质蛋白酶（Metallomatrix proteinase，MMP）的表达增加，抑制胶原的合成，进而造成光老化的特征性改变[4]。LCs是皮肤免疫系统的重要组成部分，位于与外界环境接触的表皮层。LCs可以通过变形虫样运动在角质形成细胞中穿行，具有迁徙至淋巴结并启动免疫反应的能力。文献表明，LCs会随着皮肤老化出现数量水平的减少，并且其向淋巴结迁徙的能力也会下降[5]。另外，研究认为不同波长的紫外线均可对LCs的数量及形态状况造成影响，中波紫外线（UVB）对LCs的影响表现在表皮LCs数量减少或消失、LCs抗原呈递功能以及活化T细胞作用受到影响等方面。长波紫外线（UVA）可以导致表皮LCs数量减少，降低其抗原抗原呈递功能，引起胞膜免疫共刺激分子表达水平降低等[6]。在形态上，光老化皮肤中的LCs常呈现出胞体较小、树突结构短且分支少的表现[7]。综上，表皮中LCs的细胞数量、形态结构状况可以看做是表征皮肤免疫状态的重要指标[8]。

炎症因子在皮肤光老化的炎症机制中起着重要作用。在受到紫外线刺激时，角质细胞分泌的炎症因子水平上升，从而引起炎性细胞浸润、促进皮肤炎症反应产生。IL-6能诱导MMP合成增加，促进细胞外基质的降解。TNF-α是炎症反应中最重要的炎症因子，具有激活免疫细胞，并促进其他炎症因子释放的作用[9]。受到紫外线照射以及机体的免疫功能水平下降时，皮肤中IL-1、IL-6、IL-7、TNF-α等促炎因子的水平出现升高现象[10]。炎症因子水平的增加对皮肤免疫系统也有一定的影响[11]。研究认为，TNF-α、IL-1β等炎症因子的过度释放，一定程度上促进了表皮LCs的迁移，减少了表皮LCs数量，是影响皮肤免疫功能的重要因素[12]。由此，皮肤免疫抑制与炎症反应之间存在着机制上的联系。因此，改善皮肤免疫细胞功能、抑制炎症因子的分泌可以看作是防治皮肤光老化的重要手段。

中医学认为，肾为一身之本，肾中精气的盛衰主宰人体的生命活动过程。《素问·上古天真论篇》曰：“女子七岁，肾气盛，齿更发长……五七，阳明脉衰，面始焦，发始堕”，提示肾中精气是机体生长发育的基础。随着年龄增长，肾中精气逐渐衰少，皮肤就会表现出面容憔悴、皱纹丛生的老化现象[13]。卫气是人体中行于脉外，具有防御保护作用的气。《内经·灵枢·本脏》中指出：“卫气者，所以温分肉，充肌肤，肥腠理，司开阖者也”。卫气能充养肌肤、防御外邪，与西医学中免疫系统的作用相一致。卫气的生成受到肾气的调控，《灵枢·邪客》有“地有泉脉，人有卫气”，取类比象，用泉脉以喻水出地下，卫出下焦肾，也是对卫气的生成和肾关系密切的理论佐证。因此，肾的活动与机体的免疫功能的盛衰联系密切。所以，通过补肾来调节皮肤免疫功能、延缓皮肤衰老具有一定的理论依据。

十精丸方中以补肾药居多，其中熟地黄、枸杞子补肝益肾、滋阴养血，山茱萸、肉苁蓉和菟丝子补益肝肾、温中壮阳、收涩固脱，有阴阳并补兼以收涩之功。全方合用，可共奏补肾养心、驻颜防衰之效[14]。现代药理研究认为，地黄的药理作用全面，有止血、抗感染、抗高血压、免疫增强、抗炎的作用[15]。枸杞多糖能增强机体免疫力，增强T淋巴细胞和B淋巴细胞的免疫功能[16]。山茱萸多糖有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化和清除自由基的作用[17]。菟丝子能调节免疫、调节生殖内分泌、营养神经、抗氧化及衰老[18]。肉苁蓉多糖有调节免疫活性、抗衰老、改善学习记忆障碍的功能[19]。前期实验结果表明，十精丸可以增强老龄大鼠SOD活力、降低机体MDA含量，提高机体抗氧化能力、加速自由基清除，对皮肤光老化有一定改善作用[20]。十精丸的含药血清可以降低MMP-1并提高基质金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）的表达，拮抗紫外线对成纤维细胞的损伤[21]。

综述所述，十精丸可以提高光老化皮肤中的LCs数量水平，并改善LCs细胞异常形态。并且十精丸对于皮肤组织及血清中炎症因子IL-6、TNF-α的含量水平也具有一定的降低作用。表明十精丸能够调节皮肤免疫功能，减少炎症因子释放，抑制炎症反应，改善皮肤衰老状态。此结论为进一步论证十精丸补肾益气、延衰驻颜的功效提供了实验依据。

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[收稿日期]2023-05-23

本文引用格式：孙在峥，曹惠妍，马伟，等.十精丸对光老化大鼠皮肤LCs及炎症因子水平影响的研究[J].中国美容医学，2024，33（2）：51-55.