一测多评法联合化学计量学及熵权优劣解距离分析综合评价青钱柳药材质量

张富丽 ，管海波 ，户军燕 ，王志斌，赵明霞

1. 郑州大学第五附属医院药学部，河南 郑州 450000

2. 郑州大学第五附属医院 精准用药实验室，河南 郑州 450000

3. 郑州大学第五附属医院 处方前置审核中心，河南 郑州 450000

4. 河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046

青钱柳为胡桃科植物青钱柳Cyclocarya paliurus(Batal.) Iljinsk.的干燥叶[1-2]，分布于贵州、湖南、安徽、江西、浙江、福建、四川等地[3]。主要含有黄酮化合物、酚类、多糖、常量及微量元素等物质[4-6]。具有生津止渴、祛风止痒、消肿止痛之功，研究发现其通过保护胰岛细胞、调节胰岛素信号通路、促进葡萄糖利用等发挥改善糖代谢的作用，并通过调控脂质代谢通路、抑制脂质过氧化等发挥改善脂代谢的作用[7]；青钱柳三萜可降低Akt 和内皮型一氧化氮合酶的磷酸化水平及Rho 激酶和精氨酸酶2 的表达水平，从而改善肾内皮功能，缓解H2O2诱导的内皮损伤[8]，还可通过PI3K/Akt/m TOR 依赖性自噬抑制NLRP3 炎症小体的表达，从而改善由高尿酸引起的痛风[9]；青钱柳多糖可逆转糖尿病组小鼠体内尿酸水平的升高[10]，进而改善链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病；其提取物还可通过脂肪自噬途径清除肝脏脂肪，改善非酒精性脂肪肝病[11]；青钱柳还是“天然抗氧化剂”，其黄酮类成分与体内自由基结合成的化合物，可清除自由基而达到抗氧化的效果[12]。总之青钱柳的药用价值非常高。青钱柳未收录于中国药典，曾被一些地方标准收录[13-16]，但这些标准的质量控制仅局限于显微鉴别、薄层鉴别及其他一般的检查项目，涉及的含量测定也仅有1到2 个成分的检测，均不能全面科学地评价青钱柳整体质量，因此开展对青钱柳整体质量控制和品质评价研究对确保临床应用疗效一致性具有重要意义。本实验收集贵州、湖南、安徽、江西、浙江、福建、四川等7 省18 批次青钱柳药材，采用一测多评（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）法同时测定青钱柳中金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、齐墩果酸、熊果酸、阿江榄仁酸、青钱柳苷H、科罗索酸、白桦脂酸、山楂酸和α-乳香酸的含量，借助主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析等方法对14 个成分测定结果进行分析，再结合熵权TOPSIS 法对其质量优劣性进行排序，旨为青钱柳的质量评价及全面有效建立青钱柳的质量标准提供依据。

1 试药与仪器

1.1 主要药品与试剂

对照品熊果酸、槲皮素、异槲皮苷、齐墩果酸和金丝桃苷（批号分别为110742-201823、100081-201610、111809-202205、110709-202109 和111521-202310，质量分数依次为99.9%、99.1%、96.3%、95.8%和94.7%）源于中国食品药品检定研究院；对照品白桦脂酸、山楂酸、阿福豆苷、科罗索酸、山柰酚、α-乳香酸、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷和阿江榄仁酸（批号分别为PRF8010444、PRF908292、PRF9092622 、 PRF8092102 、 PRF23101326 、PRF8052701、PRF9113022 和PRFM2305301，质量分数依次为99.9%、99.8%、99.6%、99.6%、99.3%、99.2%、98.0%和98.0%）源于成都普瑞法科技开发有限公司；青钱柳苷H（批号WQK2204095，含量98.0%）源于四川省维克奇生物科技有限公司；青钱柳药材采集地信息见表1；乙腈、磷酸、配流动相用甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂为分析纯。

表1 青钱柳药材信息Table 1 Medicinal materials information of C. paliurus

1.2 主要仪器

Thermo Ultimate 3000 型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher 公司），2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；XS205Du 型电子分析天平（瑞士梅特勒公司），4020P 型超声波清洗器（韩国JAC 公司）；色谱柱Venusil MP C18、Waters Xbridge C18、Boston Boschrom C18，规格均为（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

精密称取14 个对照品各适量，用75%甲醇制备金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、齐墩果酸、熊果酸、阿江榄仁酸、青钱柳苷H、科罗索酸、白桦脂酸、山楂酸和α-乳香酸质量浓度分别为4.812、6.190、1.128、2.870、0.412、0.158、0.104、1.470、0.048、0.232、0.890、0.072、0.630 和0.308 mg/mL 的混合对照品母液，精密吸取该母液1 mL，置20 mL 量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取粉碎的青钱柳粉末约1 g，精密称定，于25 mL 量瓶中，加溶剂20 mL，超声处理45 min，放至常温，溶剂定容，摇匀，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱：Venusil MP C18柱，柱温30 ℃；流动相乙腈（A）-0.2%磷酸梯度洗脱（0～11 min，17.0%A；11～34 min，17.0%～40.0% A；34～66 min，40.0%～65.0% A；66～75 min，65.0%～17.0% A）；检测波长360 nm（0～35 min 检测金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素和山柰酚）、210 nm（35～43 min 检测齐墩果酸、熊果酸、阿江榄仁酸、青钱柳苷H、科罗索酸、白桦脂酸、山楂酸和α-乳香酸），体积流量1.0 mL/min，进样量10 µL。

2.4 HPLC 方法学考察

2.4.1 专属性试验 取“2.1”和“2.2”项下2 种溶液，按上述色谱条件测定。曲线图谱（图1）显示供试品溶液中14 种成分的出峰位置与对照品基本一致，且色谱峰对称性好，与相邻色谱峰分离度符合《中国药典》2020 年版要求，理论板数按各成分计均大于5 000。

图1 混合对照品 (A) 和青钱柳样品 (B) 的HPLC 色谱图Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed control substance (A) and C. paliurus sample (B)

2.4.2 线性回归试验 精密吸取混合对照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 和5.0 mL，分别用上述溶剂定容至20 mL 量瓶，摇匀制得系列浓度从低到高的混合对照品溶液1～6。精密吸取溶液1～6 各10µL，分别注入液相色谱仪，记录峰面积，以对照品质量浓度对峰面积进行线性回归，得标准曲线、相关系数及回归方程。详见表2。

表2 青钱柳中各成分的线性回归结果Table 2 Results of linear regression of each constituent in C. paliurus

2.4.3 精密度试验 取青钱柳（S1）样品制成的供试品溶液1 份，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，结果金丝桃苷等14 个成分峰面积的RSD 值依次为0.66%、0.52%、1.06%、0.83%、1.38%、1.54%、1.67%、0.71%、1.68%、1.46%、1.15%、1.65%、1.22%和1.39%，表明仪器精密度良好，可以满足试验检测。

2.4.4 稳定性试验 取青钱柳（S1）样品按“2.2”项下方法制成的供试品溶液，分别于室温下放置0、2、5、9、14、20 和24 h 时，按2.3 项下色谱条件进样，结果金丝桃苷等14 个成分峰面积的RSD 值依次为1.01%、0.95%、1.58%、1.05%、1.61%、1.55%、1.85%、1.12%、1.91%、1.78%、1.46%、1.63%、1.55%和1.71%，表明青钱柳供试品溶液24 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取青钱柳（S1）样品6 份，分别按“2.2”项下方法制成供试品溶液，各精密吸取10 µL，分别注入液相色谱仪，记录金丝桃苷等14个成分的峰面积，加载2.4.2 项的标准曲线，用外标法计算14 个成分的含量，计算各成分含量的RSD值依次为1.09%、0.91%、1.28%、1.16%、1.76%、1.85%、1.79%、1.32%、1.96%、1.76%、1.27%、1.85%、1.67%和1.80%，表明重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取已知14 个成分含量的青钱柳（S1）细粉9 份，每份约0.5 g，精密称定，分别按已知各成分含量的80%、100%、120% 3 个水平加入混合对照品溶液（每mL 含3.192 mg 金丝桃苷、4.503 mg 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、0.814 mg异槲皮苷、1.957 mg 阿福豆苷、0.218 mg 槲皮素、0.084 mg 山柰酚、0.059 mg 齐墩果酸、0.997 mg 熊果酸、0.027 mg 阿江榄仁酸、0.138 mg 青钱柳苷H、0.482 mg 科罗索酸、0.041 mg 白桦脂酸、0.359 mg山楂酸和0.168 mg α-乳香酸），每个水平各3 份，再按“2.2”项方法制得加样供试品溶液，各精密吸取10 µL，分别注入液相色谱仪，计算14 种成分的平均加样回收率100.08%、100.14%、99.46%、99.74%、97.59%、97.89%、96.94%、99.56%、97.16%、98.63%、99.52%、96.97%、99.03%和98.42%；RSD分别为0.63%、0.87%、1.29%、0.68%、1.32%、1.03%、1.44%、1.27%、1.48%、1.51%、0.99%、1.36%、1.52%和1.55%，表明本实验方法具有良好的回收率。

2.5 一测多评法的建立[17]

2.5.1 相对校正因子（f）的计算 取“2.4.2”项6个混合对照品溶液，以熊果酸为参照物，按“2.3”项下色谱条件进样测定，依公式计算，结果见表3。

表3 青钱柳中各种成分的f 值Table 3 f value of each component in C. paliurus

f为相对校正因子、ρi和Ai分别为内参物质量浓度和峰面积、ρs和As为其他待测成分质量浓度和峰面积

2.5.2f耐用性考察 精密吸取混合对照品溶液，选用Thermo Ultimate 3000 型和2695 型HPLC 系统与和Venusil MP C18色谱柱、Waters Xbridge C18色谱柱、Boston Boschrom C18色谱柱，体积流量为（1.0±0.2）mL/min，柱温（30±5）℃等条件，分别考察色谱系统及色谱柱、体积流量和柱温的改变对f的影响。每次进样10 µL，记录峰面积。结果见表4～6，表明仪器与色谱柱、体积流量和柱温的改变对所建立的f均无较大影响。

表4 不同色谱柱对f 的影响Table 4 Effect of different chromatographic columns on f

表5 不同体积流量对f 的影响Table 5 Effec of different volume flow rates on f

表6 不同柱温对f 的影响Table 6 Effect of different column temperatures on f

2.5.3 相对保留时间的测定 记录“2.5.2”项下不同HPLC 仪与不同色谱柱时14 个成分的保留时间，以熊果酸为内参物，采用相对保留时间值（t）法对色谱峰进行定位。结果各成分t值的RSD均≤1.87%（表7），表明各待测成分的t值波动较小，无显著差异，可以对青钱柳中多组分色谱峰进行准确定位。

表7 各待测成分的相对保留时间值Table 7 t of each component to be tested

2.6 含量测定

取18 批青钱柳（S1～S18），按“2.2”项下方法制备供试品溶液（每批平行制备3 份），取各供试品溶液10 µL，注入液相色谱仪，测定金丝桃苷等14 个成分的峰面积，加载“2.4.2”项标准曲线，采用外标法计算青钱柳中14 种成分的含量；再以熊果酸为内参物，运用“2.5.1”项下所得f的均值，采用QAMS 法计算各组分含量。对每一成分2 种方法所得含量数据进行t检验（表8）。结果P＞0.05，表明2 种方法差异不明显。

表8 青钱柳中14 种成分含量测定结果及比较 (n＝3)Table 8 Content determination results and comparison of 14 components in C. paliurus (n＝3)

2.7 化学计量学方法的建立[18]

2.7.1 主成分分析（principal component analysis，PCA） 以18 批青钱柳中14 个成分QAMS 法计算的含量数据为变量构建14×18 阶矩阵，采用SPSS 26.0 统计软件提取主成分，得各主成分方差分析表（表9）和成分矩阵表（表10）。选取特征值大于1的公因子为主成分，结果前2 个主成分的方差贡献率分别为69.443%和20.155%，特征值分别为9.722和2.822，累积方差贡献率为89.598%，表明前2 个主成分因子能够解释14 个成分89.598%的原始变量。由表10 可知，第1 主成分主要反映金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素、山柰酚、熊果酸、青钱柳苷H、科罗索酸、山楂酸和α-乳香酸等成分的综合信息，第2 主成分则集中了齐墩果酸、阿江榄仁酸和白桦脂酸的信息。为查找18 批青钱柳的相关性与差异性，将14×18阶矩阵导入SIMCA 14.1 软件构建PCA 模型（图2），结果18 批样品被分为3 类，其中S1～S8 为一组，S9～S12 为一组，S13～S18 为一组，表明不同产地青钱柳的质量存在差异。

图2 18 批青钱柳的PCA 得分图Fig. 2 PCA score chart of 18 batches of C. paliurus

表9 18 批青钱柳主成分分析结果Table 9 Results of principal component analysis of 18 batches of C. paliurus

表10 青钱柳中14 种成分的初始因子载荷矩阵Table 10 Primary factor loading matrix of 14 components in C. paliurus

2.7.2 正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLSDA） 为挖掘14 个指标成分中哪些成分是引起青钱柳产品质量差异的主要潜在标志物，继续运用SIMCA 14.1 软件建立OPLS-DA 模型（图3），结果18 批样品聚类更明显，其中S9、S10、S11 和S12位于得分图右方；S3、S2、S5、S7、S4、S8、S6 和S1 位于得分图中上方；S18、S13、S17、S15、S14和S16 位于得分图左下方。结合变量重要性投影（VIP）法，以1 为VIP 的阈值为筛选标准[19]，筛选引起青钱柳样品质量差异的主要潜在标志物，VIP值越大，表明该成分对青钱柳组间质量差异的影响越大，18 批青钱柳各成分VIP 图见图4。其中VIP槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷＝1.869 0、VIP金丝桃苷＝1.720 9、VIP熊果酸＝1.352 4、VIP阿福豆苷＝1.269 5、VIP异槲皮苷＝1.010 9，表明这5 个成分是影响青钱柳产品质量的主要潜在标志物。

图3 18 批青钱柳样品的OPLS-DA 模型得分图Fig. 3 Score chart of OPLS-DA model of 18 batches of C.paliurus samples

图4 18 批青钱柳的VIP 图Fig. 4 VIP image of 18 batches of C. paliurus

2.8 熵权TOPSIS 法（entropy weight-TOPSIS，EW-TOPSIS）分析[20]

以18 批青钱柳中14 种成分QAMS 法含量检测数据为变量建立初始化决策矩阵，采用越大越优型指标计算公式，对原始含量数据进行归一化处理（表11）。

表11 18 批青钱柳中各指标归一化处理结果Table 11 Results of normalization treatment for each index of 18 batches of C. paliurus

Xij和Yij分别为原始含量数据和数据归一化后数据，max(xj)和min（xj）分别为各成分含量数据的最大值和最小值

再以“2.7.2”项中各成分的VIP 值作为各指标权重（Wj），运用公式Zij＝Yij×Wj构建加权决策矩阵（表12），得最优方案Zj+＝1.720 9、1.869 0、1.010 9、1.269 5、0.488 8、0.378 1、0.543 0、1.352 4、0.445 8、0.833 6、0.673 5、0.583 2、0.663 3 和0.527 9，最劣方案Zj-均为0。采用评价指标与正负理想解距离计算公式，计算理想解方案（Di+）和负理想解方案（Di-）及各评价指标的评分（Ci），结果见表13。

表12 18 批青钱柳加权矩阵Table 12 Weighting matrix of 18 batches of C. paliurus

表13 18 批青钱柳药材质量评价排序Table 13 Relative ordering of quality evaluation of 18 batches of C. paliurus medicinal materials

EW-TOPSIS 分析结果显示，Ci排名前6 位的依次为S16、S14、S15、S13、S17 和S18，分别来自贵州和四川，Ci值均大于0.6，表明这2 个产区所得青钱柳整体质量最佳。

3 讨论

3.1 供试品提取方法的确定

本实验在制备供试品溶液时，同时以色谱峰丰度、峰形、分离度、杂质数量为评价指标，分别考察了不同浓度的甲醇溶液采用超声或加热回流，提取30、45、60 min 时的提取效果，结果显示75%甲醇超声提取45 min 时得到的14 种成分色谱峰响应值较大、峰形、分离度较好，杂质较少。

3.2 色谱条件的确定

本实验通过对14 个指标成分溶液进行全波长扫描，观察各成分光谱曲线中的最大吸收，结合中国药典及相关文献报道[21-22]，最终确定采用360 nm检测金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、异槲皮苷、阿福豆苷、槲皮素和山柰酚，210 nm 检测齐墩果酸、熊果酸、阿江榄仁酸、青钱柳苷H、科罗索酸、白桦脂酸、山楂酸和α-乳香酸，各成分在该条件下响应值较大，峰形尖锐，青钱柳供试品溶液在该条件下检测时基线相对平稳，且各成分分离度良好。本实验在筛选流动相时，首先考察了基础流动相系统：甲醇-水和乙腈-水，结果乙腈-水系统洗脱效果较好，但金丝桃苷色谱峰与槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷不能完全分离，遂加入磷酸溶液（0.05%、0.1%、0.2%）进行调节，结果以乙腈-0.2%磷酸溶液作为流动相系统时，洗脱效果最佳。

3.3 质量分析结果评价

本实验采用HPLC-QAMS 法对18 批青钱柳中14 个成分进行定量测定，再结合化学计量学中常用的PCA 和OPLS-DA 法对检测结果进行分析，结果18 批不同产地青钱柳明显聚为3 类，呈现一定的产区差异。OPLS-DA 分析发掘出影响青钱柳产品质量的主要潜在标志物为槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、熊果酸、阿福豆苷和异槲皮苷。EW-TOPSIS结果显示贵州和四川地区所得青钱柳整体质量较好，其次为湖南、江西和安徽。

4 结论

本实验建立的方法可操作性强，有效降低了检验成本，有利于多指标成分定量控制模式的普及应用，也为该药材的道地性研究提供了基础，有助于青钱柳优质种源的研究与开发。同时中药材质量受产地土壤、气候、海拔、水质、生态环境等多因素影响[23]，后续将扩大样品采集地，收集土壤、气候、海拔等参数，进一步挖掘影响产品质量差异性因素。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突