基于改进AHP-熵权-关联度及化学计量学的经典名方一贯煎提取工艺研究

牛成琳，殷洪梅, ，宋明明 ，周 茆 ，丁 涵，徐殿红，陈 娅 ，王振中, ，肖 伟,

1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023

2. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001

3. 中药制药过程控制与智能制造技术全国重点实验室，江苏 连云港 222001

经典名方一贯煎收录于《古代经典名方关键信息表（7 首方剂）》[1]，出自《续名医类案》（清·魏之琇）[2]，方由生地黄、当归、北沙参、麦冬、枸杞子、川楝子6 味中药组成，有滋阴疏肝之效，临床上多用于治疗肝病、胃病、慢性便秘、妇科疾病及抑郁症等[3-6]。为了更好地应用于临床，将经典方剂转换为便捷、使用依从性强的剂型，从而解决汤剂带来的弊端。在国家发布诸多经方相关的鼓励性政策大环境下，开展经方一贯煎制剂的工艺研究，对于确保现代化制剂在临床上使用安全、有效具有重要意义。

基于质量源于设计原则，在工业化生产中对关键工艺参数（critical process parameters，CPPs）进行逐步优化，以基准样品为切入点，达到经典名方复方制剂关键质量属性（critical quality attributes，CQAs）与其基本一致[7-8]。为确保经方制剂质量，需对药材、饮片、基准样品及制剂等多个环节实行全过程质量监控，从物理、化学等多方面综合考虑，把控经方研究过程中的CQAs，加强专属性鉴别和多成分、整体质量的控制[9]，根据一贯煎化学成分及临床应用研究，结合各药材药典质控成分，选取地黄苷D、毛蕊花糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、甜菜碱、对香豆酸为含量测定的指标成分，本实验实行多个质量评价指标，从定性和定量2 个维度综合把控提取工艺。考虑到工业化生产的可行性，生产设备与工艺条件的适配度，基于经典名方制剂与物质基准的质量控制指标应基本一致原则，采用基准样品关联度评价样品与基准样品的质量一致性。根据经方的君臣佐使、用药量等多方面综合确定评价指标的主观权重系数，将1～9 标度法与e0/4～e8/4标度法相结合，综合考量2 种标度法的优缺点，增强权重值的信度，熵权法确定评价指标的客观权重系数[10]。

改进主观评价层次分析法（analytic hierarchy process，AHP）-熵权法确定组合权重，构建以组合权重评估，将定性指标与定量指标相结合的可靠提取工艺优选体系，结合Box-Behnken 设计-响应面法进行模型预测[11]，以期得到合理、稳定、可行的最优提取工艺，并为后续制剂制备和质量控制研究提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

全自动分体式多功能煎药壶（多用煲），潮州市潮安区金石镇中雄家用电器厂；JY20002 型电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Mettler Toledo XP6 型百万分之一电子分析天平、Mettler Toledo AL204 型万分之一电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；ACS-D 型三峰牌电子秤，上海乾峰电子仪器有限公司；HWS26 型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；DZTW 型电子调温电热套，上海本亭仪器有限公司；KB-500DB 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Agilent 1200 型高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；Milli-Q 型超纯水仪，美国密理博公司。

1.2 试药

生地黄饮片，批号YP220815，产地河南，购自大连大仁堂药业有限公司；当归饮片（批号YP220408，产地甘肃甘南藏族自治州卓尼县）、川楝子（批号Y2204016，产地四川省成都市丽春镇）、北沙参（批号Y220423，产地内蒙古良西）、枸杞子（批号Y2204005，产地甘肃靖远县），均购自江苏三和兴中药研究有限公司；麦冬，批号Y220403，产地四川省三台县，购自河北荷花池药业有限公司。

对照品地黄苷D（批号112063-202103，质量分数94.2%）、阿魏酸（批号110773-201915，质量分数99.4%）、甜菜碱（批号110894-202105，质量分数98.5%），对香豆酸（批号112037-202102，质量分数99.7%）、毛蕊花糖苷（批号111530-201914，质量分数95.2%），中国食品药品检定研究院；对照品洋川芎内酯I（批号13176，质量分数98%），上海诗丹德生物技术有限公司。乙腈、甲醇，色谱级，北京迈瑞达科技有限公司；超纯水，自制。

2 方法与结果

2.1 一贯煎提取液的制备

称取生地黄、枸杞子各67.14 g，北沙参、麦冬、当归各33.6 g，川楝子44.76 g，共279.84 g，置于5 L 圆底烧瓶中，加入一定倍量纯化水浸泡30 min，加热回流提取，以200 目滤布立即滤过，即得。

参照课题组前期一贯煎物质基准制备工艺研究，根据医疗机构中药煎药室管理规范将全方至于煎药壶用水煎煮2 次即得基准样品[12]。

2.2 地黄苷D 含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 取地黄苷D 对照品适量，精密称定，用25%甲醇充分溶解，配成质量浓度为491.72 μg/mL 的地黄苷D 对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 移取一贯煎提取液于2 mL 离心管内，12 000 r/min 离心5 min，取上清液过0.45 μm 微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2.3 色谱条件[13]色谱柱为Waters HSS T3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液（5∶95）；体积流量1 mL/min；检测波长为203 nm；柱温30 ℃；进样体积10 μL；色谱图见图1。

图1 地黄苷D 对照品 (A) 和一贯煎基准样品 (B) 的HPLC 图Fig. 1 HPLC of rehmannioside D reference substances (A)and Yiguanjian benchmark samples (B)

2.2.4 线性关系考察 取“2.2.1”项下地黄苷D 对照品溶液逐级稀释，按“2.2.3”项下色谱条件测定不同质量浓度下地黄苷D 的色谱峰峰面积，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程：地黄苷DY＝12.161 1X－3.570 1，R2＝1.000 0，线性范围7.38～73.76 μg/mL。

2.2.5 精密度考察 按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件连续进样6 次，测定地黄苷D 的峰面积，计算其峰面积的RSD 值为0.99%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性考察 取供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件分别在制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，测定地黄苷D 的峰面积，计算RSD 值为1.31%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 精密称定6 份样品，按照“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件进行测定，计算地黄苷D 的含量RSD 值为0.75%，表明试验方法重复性较好。

2.2.8 加样回收率考察 取已知含量的样品精密称定，置具塞锥形瓶中，平行9 份，每3 份1 组，分别精密加入与样品中相应成分含量相等的对照品储备液1、2、3 mL，按“2.2.2”项方法操作得到加标溶液，按“2.2.3”项下色谱条件测定，计算地黄苷D 的平均加样回收率为103.90%，RSD 值为2.52%，表明该方法准确度良好。

2.3 甜菜碱含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 取甜菜碱对照品适量，精密称定，加甲醇充分溶解，配成质量浓度为504.8 μg/mL 的甜菜碱对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 按照《中国药典》2020年版枸杞子项下“供试品溶液制备”方法，取一贯煎提取液约3 g，精密称定，置10 mL 量瓶中，加入甲醇适量，超声处理30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过。精密量取续滤液2 mL，置碱性氧化铝固相萃取柱（2 g）上，用乙醇60 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。

2.3.3 色谱条件 色谱柱为Waters X bridge BEH Amide 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（85∶15）；体积流量1 mL/min；检测波长195 nm；柱温30 ℃；进样体积10 μL。色谱图见图2。

图2 甜菜碱对照品 (A) 和一贯煎基准样品 (B) 的HPLC 图Fig. 2 HPLC of betaine reference substances (A) and Yiguanjian benchmark samples (B)

2.3.4 线性关系考察 取“2.3.1”项下对照品溶液逐级稀释，按“2.3.3”项下色谱条件分别测定不同质量浓度下甜菜碱的色谱峰峰面积，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程：甜菜碱Y＝4.536X＋0.802 8，R2＝0.999 9，线性范围10.10～201.90 μg/mL。

2.3.5 精密度考察 按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件连续进样6 次，测定甜菜碱的峰面积，计算其峰面积的RSD 值为0.94%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性考察 取供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件分别在制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，测定甜菜碱的峰面积，计算其RSD 值为0.74%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 精密称定6 份样品，按照“2.3.2”项下方法分别平行制备6 份供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进行测定，计算甜菜碱质量分数的RSD 值为1.58%，表明试验方法重复性较好。

2.3.8 加样回收率考察 取已知含量的样品精密称定，置具塞锥形瓶中，平行9 份，每3 份1 组，分别精密加入与样品中相应成分含量相等的对照品储备液1、2、3 mL，按“2.3.2”项下方法操作得到加标溶液，按“2.3.3”项下色谱条件测定，计算甜菜碱的平均加样回收率为97.07%，RSD 值为1.71%，表明该方法准确度良好。

2.4 多成分含量测定

2.4.1 对照品溶液的制备 取对香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I 对照品适量，精密称定，用70%甲醇充分溶解，分别配成质量浓度分别为对香豆酸66.10 μg/mL、阿魏酸138.13 μg/mL、毛蕊花糖苷52.26 μg/mL、洋川芎内酯I 72.41 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备 同“2.2.2”项下的制备方法。

2.4.3 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse XDBC18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱条件为0～15 min，25%～35%甲醇；15～25 min，35%～42%甲醇；体积流量1 mL/min；检测波长为280 nm；柱温30 ℃；进样体积10 μL。色谱图见图3。

图3 混合对照品 (A) 和一贯煎基准样品 (B) 的HPLC 图Fig. 3 HPLC of mixed reference substances (A) and Yiguanjian benchmark samples (B)

2.4.4 线性关系考察 取“2.4.1”项下对照品溶液逐级稀释，按“2.4.3”项下色谱条件分别测定不同质量浓度下对香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷和洋川芎内酯I 的色谱峰峰面积，以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），分别对对香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷和洋川芎内酯I 质量浓度进行线性回归，得回归方程分别为对香豆酸Y＝45 858.0X＋5 889.8，R2＝0.999 8，线性范围0.52～33.05 μg/mL；阿魏酸Y＝28 238.0X＋3 896.7，R2＝0.999 8，线性范围1.08～69.06 μg/mL；毛蕊花糖苷Y＝9 715.4X－2 483.3，R2＝0.999 9，线性范围0.41～26.13 μg/mL；洋川芎内酯IY＝38 500.0X－1 716.0，R2＝0.999 8，线性范围0.57～36.21 μg/mL。

2.4.5 精密度考察 按照“2.4.2”项方法制备供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件连续进样6 次，分别测定对香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I 的峰面积，计算其RSD 值分别为0.52%、1.21%、2.30%、1.95%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性考察 取供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件分别在制备后0、2、4、6、8、12、18、24 h 进样测定，分别测定对香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I 的峰面积，计算其RSD 值分别为1.15%、2.02%、2.47%、1.98%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.7 重复性考察 精密称定6 份样品，按照“2.4.2”项方法，分别平行制备6 份供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件进行测定，分别计算对香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I 质量分数的RSD值分别为1.47%、1.65%、2.10%、0.72%，结果表明该试验方法重复性较好。

2.4.8 加样回收率考察 取已知含量的样品精密称定，置具塞锥形瓶中，平行9 份，每3 份1 组，分别精密加入与样品中相应成分含量相等的对照品储备液1、2、3 mL，按“2.4.2”项方法操作得到加标溶液，按“2.4.3”项色谱条件测定，分别计算对香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I 的平均加样回收率为90.63%、105.74%、97.78%、92.81%，RSD 值分别为2.48%、2.90%、2.66%、2.36%，表明该方法准确度良好。

2.5 出膏率的测定

取105 ℃烘干至恒定质量的蒸发皿，记录质量（m1）；精密称取提取液20 g 于蒸发皿中，水浴蒸干后，移入烘箱，105 ℃干燥5 h，取出放干燥器，放冷后称定质量，再次放入烘箱内105 ℃干燥1 h，取出称重，至恒定质量，记录质量（m2）。固含量和出膏率计算公式如下。

固含率＝(m2－m1)/20 （1）

出膏率＝固含率×提取液总量/饮片投料质量（2）

2.6 指纹图谱的建立

2.6.1 供试品溶液的制备 同“2.2.2”项下的制备方法。

2.6.2 色谱条件 色谱柱为Waters HSS T3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；体积流量1 mL/min；检测波长为280 nm；柱温30 ℃；进样体积10 μL；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱条件为0～12 min，0～2%乙腈；12～25 min，2%～8%乙腈；25～35 min，8%～11%乙腈；35～50 min，11%～22%乙腈；50～60 min，22%～40%乙腈；60～70 min，40%～90%乙腈；70～80 min，90%乙腈。

2.6.3 精密度考察 按照“2.6.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.6.2”项下色谱条件连续进样6 次，分别计算指纹图谱相似度，相似度＞0.942，表明仪器精密度良好。

2.6.4 稳定性考察 取供试品溶液，按“2.6.2”项下色谱条件分别在制备后0、4、8、12、16、20、24 h 进样测定，分别计算指纹图谱相似度，相似度＞0.935，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6.5 重复性考察 精密称定6 份样品，按照“2.6.1”项方法分别平行制备6 份供试品溶液，按“2.6.2”项下色谱条件进行测定，分别计算指纹图谱相似度，相似度＞0.942，表明试验方法重复性较好。

2.6.6 指纹图谱分析 按照“2.6.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.6.2”项下色谱条件测定，记录色谱图，结果见图4。导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》中进行数据分析，以基准样品色谱图S 为参照谱图，选择特征明显、重复性好、稳定性好的7 个色谱峰为共有峰，经多点校正后进行相似度计算。

图4 一贯煎样品的HPLC 指纹图谱Fig. 4 HPLC fingerprints of Yiguanjian samples

2.7 单因素考察

2.7.1 加水量 取全方饮片置于5 L 圆底烧瓶中，分别以料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 加纯化水浸泡30 min 后加热回流提取1 h，测定地黄苷D、甜菜碱、对香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I 含量。由表1 可知，地黄苷D、对香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I 成分含量及出膏率随加水量增加呈上升趋势，在12 倍量后趋于平缓，甜菜碱含量随加水倍量增加呈上升趋势，超过14 倍量后下降，故选取10、12、14 倍量3 个水平进行响应面试验。

表1 加水量对一贯煎提取工艺的影响Table 1 Effects of water addition on extraction process of Yiguanjian

2.7.2 提取时间 取全方饮片置于5 L 圆底烧瓶中，加入8 倍量纯化水浸泡30 min，分别加热回流提取30、50、70、90 min 后测定各个指标。由表2可知，地黄苷D、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I 含量随着提取时间的延长呈上升-平缓-下降趋势，甜菜碱、对香豆酸含量及出膏率随提取时间增加呈上升趋势，在70 min 后趋于平缓，故选取50、70、90 min 3 个水平进行响应面试验。

表2 提取时间对一贯煎提取工艺的影响Table 2 Effects of extraction time on extraction process of Yiguanjian

2.8 响应面试验设计

2.8.1 CQAs 和CPPs 的确定 基于以上分析，以处方指标成分甜菜碱含量、地黄苷D 含量、阿魏酸含量、出膏率、指纹图谱相似度、对香豆酸含量、毛蕊花糖苷含量、洋川芎内酯I 含量为CQAs[14]，加水量（X1）、提取时间（X2）和提取次数（X3）作为CPPs，依据经验将提取次数设计为1、2、3 次3 个水平进行响应面试验。前期基准物质研究中表明浸泡时间对指标成分无显著性差异，考虑生产中时间成本将浸泡时间定为30 min。

2.8.2 Box-Behnken 试验设计及结果 利用Design-Expert 13 软件安排3 因素3 水平的17 次试验（中心点选择重复5 次）。根据Box-Benhnken 试验设计方案进行实验，结果见表3。

表3 提取工艺响应面试验设计及结果Table 3 Response surface test design and results of extraction process

2.9 化学计量学研究

2.9.1 层次聚类分析（hierachical cluster analysis，HCA） 采用SPSS 26.0 软件，以各成分含量为变量，以平方欧氏距离为测度进行分析，结果见图5。由此可知，当欧氏距离为15 时，响应面试验设计所得溶液聚为2 类，提取液S1～S3、S5 为一类，其余为另一类；当欧氏距离为10 时，17 种溶液聚为3类，提取液S1～S3、S5 为第1 类，提取液S4、S8、S13～S17 为第2 类，提取液S6、S7、S9～S12 为第3 类。

图5 响应面试验设计所得溶液HCA 图Fig. 5 HCA plot for solutions obtained by response surface test design

2.9.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 采用SIMCA 14.1 软件，以各成分含量为变量进行分析，结果见图6。其中主成分1 方差贡献率达54.6%，前3 个主成分累积贡献率为89.9%，可将前3 个成分即甜菜碱、阿魏酸、地黄苷D 定为关键主成分；17 批提取液均在置信椭圆内，且分布相对集中，说明各批次样品有较好的质量一致性，响应面试验设计所得溶液聚为3 类，与“2.9.1”项下结果一致。

图6 响应面试验设计所得溶液PCA 得分图Fig. 6 PCA sore scatter plot for solutions obtained by response surface test design

2.9.3 偏最小二乘-判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA） 采用SIMCA 14.1软件，对各成分含量进行分析，结果见图7，可知响应面试验设计所得溶液聚为3 类，与上述构建的模型结果一致。变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值越大，对模型的贡献值就越大，以VIP＞1 为标准筛选差异组分，可知有2 种成分符合要求，VIP 值由高到低依次为甜菜碱、阿魏酸，主要来源于一贯煎臣药枸杞子、当归，表明这2 种饮片质量对全方制剂质量研究的影响较大。

图7 各成分含量VIP 值Fig. 7 VIP values of various constituent contents

2.10 改进AHP-熵权-基准样品关联度[15-16]

2.10.1 改进AHP 计算评价指标主观权重（W） 方中重用生地黄已达滋阴养血功效，臣药枸杞子益阴养肝，当归性温味甘辛，养血活血以调肝，诸药合用有滋阴疏肝之效。依据化学计量学分析及君臣佐使原则，将方中药效成分甜菜碱（A1）、阿魏酸（A2）、地黄苷D（A3）定为评价指标[17]，指纹图谱相似度（A4）作为定性标准，可反映提取液间差异性，但指标成分含量衡量其质量更为重要，通过实验结果也可以发现各个水平的出膏率（A5）及指纹图谱相似度差异不明显，故5 个评价指标的优先顺序为甜菜碱＞阿魏酸＞地黄苷D＞指纹图谱相似度＝出膏率，构成优先判断矩阵，结果见表4、5。表6 为1～9 标度法、e0/4～e8/4标度法计算出的各指标成分权重及改进后组合权重（W），见计算公式（3）。

表4 1～9 标度下指标成对比较的判断优先矩阵Table 4 Decision matrix of paired comparison of indexes on scale 1—9

表5 e0/4～e8/4标度下指标成对比较的判断优先矩阵Table 5 Decision matrix of paired comparison of indexes on scale e0/4—e8/4

表6 改进AHP 评估指标权重Table 6 Improved AHP evaluation index weight

2.10.2 熵权法计算评价指标客观权重（WO）

（1）标准化处理试验中指标成分、出膏率、指纹图谱相似度等指标，其数值越大越好，均为正向指标。按公式（4）计算[18]，式中xij为i次试验中j指标试验值，mi为该组试验值中的最小值，Mi为该组试验值中的最大值。

（2）根据信息熵的定义，计算各个指标的信息熵为E1、E2、…、E5，通过信息熵Ej计算各指标的熵权WO。

基于改进AHP-熵权法计算组合权重系数，按公式（6）计算，结果见表7。

表7 组合权重系数Table 7 Combination weight coefficient

2.10.3 基准样品关联度 以基准样品作为提取工艺优化的依据，对制剂进行整体质量控制[19]，将响应面试验设计的17 个样品与基准样品进行关联度比较，按公式（7）计算样品与基准样品的相对偏差，偏差值越小表明样品的质量属性越接近于基准样品，公式（8）计算基准样品关联度，式中xi,j为第i个评价对象第j个评价指标，sj为基准样品第j个评价指标。设矩阵X＝(xi,j)m×n（i＝1，2，…，m；j＝1，2…，n）为由m个被评估对象，n个评价指标构成的原始数据矩阵。对数据进行与基准样品的相对偏差处理得到R＝(ri,j)m×n，矩阵，对R矩阵进行基准样品关联度计算处理。

2.10.4 综合评分 用改进AHP-熵权法所得组合权重系数与基准样品关联度对结果进行综合评分，按公式（9）计算，结果见表3。

2.11 响应面结果分析及工艺验证

利用Design-Expert 13 软件对改进AHP-熵权-基准样品关联度综合评分结果进行工艺参数优化，得到各个评价指标对3 个CPPs 的二次多元试验模型，其回归方程Y＝0.955 9＋0.002 5X1＋0.024 1X2＋0.019 1X3－0.054 0X1X3－0.019 2X1X2－0.002 8X2X3－0.055 9X12－0.027 8X22－0.092 6X32。对试验模型进行方差分析，结果见表8。2 次多元模型P＜0.001，失拟项P＝0.320 7＞0.05，说明该试验拟合的模型有统计学意义，其中煎煮时间对综合评分有显著性影响，加水量和提取次数交互作用显著。该模型的相关系数大于0.9，表明其可以用来分析和预测一贯煎提取工艺参数，对模型方程进行响应面分析，得到等高线图及响应面图，结果见图8。

表8 响应面二次多元回归模型的方差分析Table 8 Variance analysis of response surface quadratic multiple regression model

图8 各因素对综合评分的影响Fig. 8 Influence of each factor on comprehensive score

软件预测的最佳提取工艺为加12 倍量水，提取时间80 min，提取次数2 次，理论预测评分0.963，3 批工艺验证的平均综合评分（表9）为0.957 3，RSD 为0.42%，说明预测的提取工艺与工艺验证的结果有良好的相关性。

表9 工艺验证试验结果Table 9 Results of process verification experiments

3 批次工艺验证样品指标成分含量转移率等5个定性、定量指标RSD 值均小于3%，证实试验模型预测的提取工艺稳定、可行。

3 讨论

经典名方工业化的提取工艺参数优化以与物质基准质量属性一致为目标[20]，但在实际工业生产中考虑到设备适配性，可行性、时间成本等因素很难与物质基准的制备工艺一致，现代工艺与传统工艺产品存在一定差异性[21]，因此遵循古方而又保障药品质量与物质基准基本一致至关重要。在提取工艺方面有文献报道[22]，加10 倍量水进行煎煮，本研究加水量单因素考察中12 倍量水煎煮所得药液的各个指标明显均高于10 倍量水。胡钰荧等[23]用各个指标的综合评分对煎煮工艺进行单因素考察，提取方式为砂锅煎煮，其煎煮时间参照《医疗机构中药煎药室管理规范》定为60 min，本实验结合单因素考察情况加以优化，为适应现代化大生产，采用了加热回流方式提取，响应面预测的提取时间80 min与前期砂锅煎煮所得的基准样品质量一致，且评价指标的综合评分为最优，在遵古而不泥古的原则下，基于现代设计手段的提取工艺研究也可用于指导一贯煎制剂的逐步放大生产。

本研究基于改进AHP-熵权-基准样品关联度的方法建立一贯煎提取工艺评估模型，以指标成分地黄苷D、阿魏酸、甜菜碱含量对提取工艺进行评价，能够快速、准确筛选CPPs，也可应用于制剂生产过程中各个环节的质量评价[24]，精准有效地实现全过程质量监控，以出膏率评价全方质量，指纹图谱相似度作为定性指标，保证制剂持续生产安全有效。改进AHP 法在较好的标度保序性及一致性的同时提高计算精度[25]，综合评分法将熵权法客观赋权与改进AHP 主观赋权相结合，可用于后期浓缩、干燥工艺考察中CPPs 的确定，更具有科学合理性。方中重用君药生地黄已达滋阴养血功效，臣药枸杞子益阴养肝，当归养血活血以调肝。常以水煎剂入药的地黄中2 大类主要的水溶性成分为环烯醚萜类和苯乙醇类，能够抑制肝脏促炎因子诱导的肝细胞凋亡，具有肝脏保护作用[26-27]，前期实验研究发现地黄饮片中由于梓醇结构的不稳定性致使含量批间差异性大，无法较好地从源头把控全方质量，毛蕊花糖苷抑制炎症相关因子及蛋白表达，具有肝保护作用[28]，地黄苷D 和毛蕊花糖苷含量高且有较强的专属性。

现代药理学研究表明，枸杞子中甜菜碱能够刺激肝脏脂肪氧化，改善线粒体功能，抑制肝纤维化，对香豆酸能够抑制抗氧化活性，防止肝、肾毒性，从而起到保护肝脏的作用[29-32]。当归中主要活性成分阿魏酸、洋川芎内酯I 均能够抑制肝内炎症，抑制活性氧类和脂质过氧化形成，减少肝脏脂肪沉积，有一定的肝脏保护作用[33-35]。本研究选取君臣药味中药效成分甜菜碱、地黄苷D、香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯I 作为考察指标，后期将展开佐使药川楝子中川楝素含量测定研究。参照中国药典甜菜碱采用氨基键合硅胶为填充剂的色谱柱进行含量测定，地黄苷D 极性大，采用对强极性化合物强保留型色谱柱可以改善分离度，故本研究采用3 个含量测定方法进行质量控制。本研究所得的提取工艺符合现代生产工艺条件，同时与物质基准的质量基本一致，可为一贯煎现代工艺大生产提供实验依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突