雷公藤红素-氨基葡萄糖酰胺偶联物的合成及其减毒调脂作用

毕 晨，游清徽

江西师范大学生命科学学院，江西 南昌 330022

雷公藤TripterygiumwilfordiiHook. f.是一种传统中药，拥有悠久的药用历史。现有研究明确指出，雷公藤具有多种药理作用，包括抗肿瘤、抗炎、抗肥胖、治疗自身免疫疾病和糖尿病等功能。此外，雷公藤还显示出神经保护、预防心血管和代谢相关疾病的效果[1-5]。雷公藤红素（celastrol，Cel）是从雷公藤植物根部提取得到的一种五环三萜类化合物，具有抗炎和抗肿瘤等良好效果[6-8]。近年来的相关研究发现，Cel 还参与机体脂质代谢的调控，并具有一定的减肥效果。刘伯宇等[9]研究发现，Cel通过提高瘦素敏感性，对于高脂饮食诱导的肥胖（diet-induced obesity，DIO）小鼠可以降低其食欲并明显减轻其体质量。然而，对于缺乏瘦素及瘦素受体的小鼠，并未观察到明显的减肥效果。另外，研究显示Cel 可以通过下调转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARγ2）和CCAAT 增强子结合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein，C/EBPα）的表达，降低早期脂肪基因的表达，并有效抑制小鼠胚胎呈纤维细胞（3T3-swiss albino，3T3-L1）向脂肪细胞的终末分化[10]。尽管Cel 具有显著的药理活性，但其对肝脏、肾脏、心脑血管等也存在强烈的不良反应，并具有较差的水溶性，从而限制了其在临床中的应用[11]。

近年来，偶联药物技术的发展使得Cel 的临床应用成为可能。为了解决Cel 本身理化性质限制以及随剂量增加而引发的药物毒性等问题，研究人员已经开发了多种药物制剂，如纳米递药系统[12-13]、聚合物胶[14]、聚合物前药[15]、脂质体[16-17]等被研发出来以提高Cel 的生物利用度。然而，Cel 相关制剂目前仍处于研发阶段，并未有产品上市。

用于聚合物-药物偶联物的材料需要具备无毒、低免疫反应以及良好的水溶性等特点，例如N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺[18]、聚乙二醇以及部分多糖聚合物（如壳聚糖、葡聚糖、透明质酸等）均为常用药物辅料。葡聚糖阿霉素前药是第1 个进入临床试验阶段的葡聚糖偶联药物，但后续研究证明其具有一定的肝毒性、会引起血小板减少等不良症状[19]。聚谷氨酸是一种人工合成的聚合物具有低免疫反应和无毒性等特点，但也存在制备成本高昂，无法普及的问题。氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）是一种含有氨基的己糖，具有改善软骨关节代谢、抗菌、抗氧化、抗炎和保肝的作用。现有临床试验证明，氨基葡萄糖没有急性毒性、亚急性毒性和遗传毒性方面的问题，其盐酸盐形式被美国国家食品营养协会（National Nutritional Foods Association，NNFA）批准为膳食补充剂[20]。

本实验研发了一种Cel-GlcN 酰胺偶联物，合成工艺见图1，并从理化性质、药物毒性和抗脂效果等方面评价该复合物。研究结果显示，该复合物的水溶性、药物毒性和氧化应激水平等方面均优于原始药物Cel。

图1 Cel-GlcN 的合成工艺Fig. 1 Cel-GlcN synthesis process

1 仪器与材料

1.1 仪器

CKX 53 型倒置光学显微镜，日本Olympus 公司；MCO-15AC 型二氧化碳细胞培养箱，日本Sanyo公司；Agilent-API4500 型液质联用仪，美国AB Sciex 公司；FW-4A 型粉末压片机，天津市拓普仪器有限公司；Spectra Max M5 型酶标仪，美国Molecular Devices 公司；Nicolet iN10 MX 型傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo Nicolet 公司。

1.2 材料与试剂

DMEM 细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、非必需氨基酸、胎牛血清蛋白、油酸、棕榈酸均购自北京索莱宝科技有限公司；GlcN 购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈购自Sigma-Aldrich 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；Cel 购自成都普思生物科技股份有限公司；N,N-乙基二异丙胺（N,Ndiisopropylethylamine，DIPEA）、二氯甲烷、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐（benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate，PyBOP）、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐［1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC·HCl］、N-羟基苯并三氮唑（1-hydroxybenzotriazole，HOBt）均购自Adamas 上海泰坦科技股份有限公司；HepG2 细胞系购自美森细胞生物科技有限公司；总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）试剂盒、2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠（bicinchonininc acid，BCA）试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司。

1.3 细胞培养

将人肝癌HepG2 细胞（美森细胞生物科技有限公司）置于含有15%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的高糖DMEM 培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

2 方法与结果

2.1 Cel-GlcN 的合成与表征

2.1.1 基于DMF 体系Cel-GlcN 的合成 在常温条件下，将Cel（100 mg、0.22 mmol）、PyBOP（57 mg、0.11 mmol）溶解于5 mL DMF（99.5%）溶剂中，随后将反应液置于冰水混合物中冷却30 min。在搅拌的条件下，缓慢滴入DIPEA（71 mg、0.55 mmol）至反应溶液中，待反应溶液恢复至室温后逐滴加入氨基葡萄糖溶液（92 mg、0.44 mol/L），持续搅拌48 h 直至反应完全。然后收集反应液，使用二氯甲烷和饱和食盐水萃取3 次（15 mL×3），有机层用无水硫酸钠干燥。在40 ℃下减压旋蒸完全后，通过硅胶柱色谱进行纯化（洗脱剂为二氯甲烷-甲醇12∶1）。最终得到棕红色固体粉末82.3 mg（61.4%）。收集所得样品后，通过LC-MS 确定其相对分子质量，使用1H-NMR、13C-NMR 对其结构进行鉴定，并通过压片法对产物进行傅里叶红外光谱（FTIR）表征。

2.1.2 基于二氯甲烷体系Cel-GlcN 的合成 在氮气氛围下，将HOBt（42.4 mg、0.22 mmol）和EDC·HCl（63 mg、0.33 mmol）加入到溶解有Cel（100 mg、0.22 mmol）的二氯甲烷溶液中，并在0 ℃的条件下搅拌15 min，待反应溶液恢复至室温后逐滴加入氨基葡萄糖溶液（92 mg、0.44 mol/L），搅拌过夜至反应完全。收集反应液，直接加入饱和食盐水洗涤3 次（15 mL×3），有机层用无水硫酸钠干燥，40 ℃下减压旋蒸完全后，通过硅胶柱色谱进行纯化（洗脱剂为二氯甲烷-甲醇14∶1）。最终得到棕红色固体粉末60.4 mg（40.5%），其表征方式与“2.1.1”项一致。

2.1.3 FTIR分析 FTIR参数：光谱范围4 000～500 cm-1；分辨率0.5 cm-1；扫描次数64；信噪比50 000∶1。Cel-GlcN 是由Cel 的羧基与GlcN 的氨基之间形成酰胺键而合成（如图1 所示），通过FTIR（图2）对酰胺键进行了验证，在Cel-GlcN 的FTIR 谱图中，1 647 cm-1处的吸收峰对应酰胺I 谱带C＝O 的伸缩振动，1 586 cm-1处的强吸收则对应酰胺II 谱带中N-H 的弯曲振动，同时，在Cel-GlcN 中观察到Cel中由C＝O 在1 702 cm-1处的伸缩振动吸收峰消失，表明酰胺键的成功引入。

图2 Cel-GlcN 的红外光谱图Fig. 2 Infrared spectra of Cel-GlcN

2.1.4 LC-MS 检测分析

（1）色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18为（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水；柱温25 ℃；进样量20 μL；体积流量1 mL/min；检测波长200～600 nm。洗脱条件：0～18 min，30%～100%乙腈；18～28 min，100%乙腈；28～30 min，100%～30%乙腈。

（2）质谱条件：电喷雾离子源（ESI），扫描方式为负离子模式；喷嘴电压4 kV；鞘气温度250 ℃；鞘气体积流量8 L/min；干燥气体积流量6 L/min；干燥器温度250 ℃；锥孔电压100 V；扫描范围m/z100～1 700。

通过LC-MS 梯度分析结果（图3、4），观察到无论是DMF 还是二氯甲烷体系中均有目标产物Cel-GlcN 的液相峰，对比分析可知，在二氯甲烷体系中不光有目标产物，同时还生成了2 种副产物（tR分别为23.891、24.916 min），其相对分子质量与目标产物Cel-GlcN 不符，Cel（tR＝21.848 min）具有较小的极性，只在纯有机相乙腈洗脱后被紫外检测器检测到。GlcN 因其结构上具有多个羟基，表现出良好的水溶性和较大的极性。在Cel 与GlcN 共价结合生成Cel-GlcN（tR＝12.819 min）后，结合物的分子极性增加，水溶性得到改善，峰出现时间也提前。同时，在对目标峰Cel-GlcN（tR＝12.819 min）进行质谱分析时（图5），初步判断其相对分子质量约为611（可能含有奇数氮化合物），基本与Cel（Mr＝450）和GlcN（Mr＝179）共价结合后去除1 个水分子后的相对分子质量相符，因而本实验在后续的实验中选择使用高产率的DMF 溶剂作为反应体系。

图4 基于二氯甲烷体系的Cel-GlcN 经LC-MS 分析的液相色谱图Fig. 4 LC-MS LC chromatogram of Cel-GlcN based on dichloromethane system

图5 Cel-GlcN 经LC-MS 分析的质谱图Fig. 5 Mass spectra of Cel-GlcN analyzed by LC-MS

2.1.51H-NMR、13C-NMR 检测

（1）氢谱参数：温度298.0 K；谱宽10 000 Hz；脉冲宽度11.11 μs；弛豫时间2 s；采样点数65 536；采样时间3 s；扫描次数16。

（2）碳谱参数：温度296.2 K；谱宽22 045.7 Hz；脉冲时间16 μs；采样时间3.65 s；弛豫时间2.0 s；采样数据点65 536；扫描次数50。

1H-NMR (400 MHz, MeOD)δ: 7.20 (2H, s), 6.49(2H, d,J= 10.2 Hz), 6.45～6.41 (1H, m), 3.79～3.69(7H, m), 3.69～3.64 (2H, m), 3.48 (1H, d,J= 6.6 Hz),3.31 (3H, s), 2.47 (2H, d,J= 15.4 Hz), 2.21 (2H, s),2.19 (6H, s), 2.15 (3H, s), 1.93～1.80 (7H, m), 1.74(7H, dt,J= 15.6, 7.5 Hz), 1.50 (7H, d,J= 14.0 Hz),1.42 (5H, s), 1.35 (4H, dd,J= 7.2, 3.7 Hz), 1.27 (9H,d,J= 6.2 Hz), 1.19 (6H, s), 1.13 (7H, s), 0.96 (3H, d,J= 15.3 Hz), 0.72 (5H, s)。

13C-NMR (100 MHz, MeOD)δ: 181.14 (C-29),180.03 (C-2), 172.56 (C-8), 166.42 (C-10), 147.75(C-3), 136.55 (C-6), 128.49 (C-5), 120.61 (C-4),119.98 (C-7), 119.61 (C-1), 92.36 (C-1′), 73.08 (C-3′),72.64 (C-4′), 72.52 (C-5′), 62.79 (C-6′), 56.11 (C-2′),46.27 (C-14), 45.83 (C-18), 44.30 (C-9), 41.53 (C-13),40.77 (C-20), 38.87 (C-24), 37.61 (C-22), 36.08(C-16), 34.73 (C-11), 34.39 (C-25), 32.07 (C-27),32.00 (C-19), 31.71 (C-15), 30.94 (C-17), 30.47(C-12), 29.75 (C-21), 22.27 (C-29), 19.69 (C-26),10.37 (C-23)。

ESI-HRMS: 分子式（C35H49NO8-），m/z610.937 6，出峰时间12.819 min，检测波长425 nm。Cel-GlcN质量分数95.46%。

2.2 水溶性及稳定性测试

精密称取3 mg 经DMF 体系合成纯化后的Cel-GlcN，溶于1 mL 去离子水中，在室温下进行漩涡震荡5 min，然后超声2 min 使其充分溶解。最后，在14 000 r/min、4 ℃下冷冻离心（离心半径5 cm）10 min，取上清液，并使用紫外分光光度计读取其在425 nm 处的吸光度（A）值。将10 mg 的Cel-GlcN分别置于50 mL 的PBS（pH 7.4）、DMEM 细胞培养基（10% FBS）、模拟胃液（SGF，0.32%胃蛋白酶，pH 1.2）和模拟肠液（SIF，1%胰酶，pH 7.5）中，以37 ℃孵育24 h。之后，在1、2、4、8、12、24 h 分别取200 μL 溶液，经醋酸乙酯萃取后进HPLC 定量分析［色谱条件：流动相为乙腈-超纯水（90∶10）；使用Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；体积流量为1.0 mL/min；温度为25 ℃；检测波长为425 nm］。

根据425 nm 处的A值数据，相比于Cel 微弱的水溶性（1.23 μg/mL），Cel-GlcN 在水中的溶解度极大地改善，达到了226 μg/mL。

如图6 所示，Cel-GlcN 在PBS 水溶液（pH 7.4）中常温保存24 h，只检测到极少量的Cel（5.5%），这表明合成的Cel-GlcN 是一个高度稳定的化合物。而在DMEM 细胞培养基、模拟胃液（SGF，pH 1.2）及SIF（pH 7.5）中常温保存24 h，检测到Cel 在SGF、SIF、DMEM 细胞培养基中的质量分数分别为23.5%、35.7%、51.1%，其水解程度均有所提高，这表明Cel-GlcN 的酰胺键可以被其中的蛋白酶或者肽酶催化水解。此外，在SGF 条件下GEL 的释放趋近于稳定，而在DMEM 细胞培养基中，12 h内释放了大量的游离Cel（48.3%），且在随后的12 h内呈缓慢上升的趋势。这表明Cel-GlcN 在DMEM细胞培养基中的释放效率更高，可能与其中胎牛血清中所含复杂的蛋白质相关。另外，在SGF 的酸性条件下，Cel-GlcN 的释放效率较低。考虑到实际情况下，药物在胃液中的转运时间约为3 h，此时间段释放的微量Cel 对药物转运并没有实际意义，说明Cel-GlcN 很可能在肠道运输中被摄取吸收，并部分转运至毛细血管。

图6 Cel-GlcN 在PBS、SGF (pH 1.2)、SIF (pH 7.5)、DMEM(10% FBS) 培养基中孵育时Cel 累积释放率随时间变化的控释曲线Fig. 6 Controlled-release curve of Cel cumulative release rate over time of Cel-GlcN incubated in PBS, SGF (pH 1.2),SIF (pH 7.5), DMEM (10% FBS) medium

2.3 Cel-GlcN 细胞毒性评价

2.3.1 细胞培养 将HepG2 细胞置于含有15%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的高糖DMEM 培养基，37 ℃、5% CO2浓度的培养箱中传代培养，保持细胞处于对数生长期。

2.3.2 MTT 检测细胞毒性 将对数生长期的HepG2 细胞经胰蛋白酶消化后，以1×105个/mL 的密度接种于96 孔板中，每孔体积为100 μL。在37 ℃、5% CO2浓度的培养箱中孵育24 h。待细胞贴壁后，分别加入0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 μmol/L 的Cel 和Cel-GlcN，并设置对照组（仅含有细胞及培养基）和空白组（无细胞）。每组设置4 个复孔。继续培养48 h 后，每孔加入100 μL MTT 溶液（终质量浓度为0.5 mg/mL）。在培养箱中孵育4 h 后，弃去上清液，并加入150 μL DMSO进行着色。振荡10 min 后，使用酶标仪在490 nm处读取每孔的A值。随后，按以下公式计算细胞存活率。

细胞存活率＝(A实验－A空白)/(A对照－A空白)

以HepG2 细胞评估了Cel 和Cel-GlcN 的体外细胞毒性。结果（表2）显示，培养至24 h 时，Cel和Cel-GlcN 的IC50值分别为（1.68±0.37）μmol/L和（2.75±0.11）μmol/L；而培养至48 h，它们的IC50值分别为（0.96±0.23）μmol/L 和（1.82±0.56）μmol/L。与原始药物Cel 相比，偶联物Cel-GlcN 对HepG2 细胞的毒性明显较弱。当载药量质量浓度相同时，偶联药物Cel-GlcN 在相同时间对HepG2 细胞活力的抑制均低于Cel。这可能是由于偶联药物中的酰胺键在培养基中逐渐断裂，缓慢释放出游离的Cel，从而减轻药物的不良反应。

表2 Cel 及Cel-GlcN 在24、48 h 内的体外细胞存活率Table 2 In vitro cell viability of Cel and Cel-GlcN within 24 h and 48 h

2.3.3 高血脂细胞模型建立与检测 根据文献报道的方法[21]，制备游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）。按以下条件制备FFA，精密称取适量的油酸和棕榈酸，按照2∶1 的比例溶解在1 mol/L KOH 溶液中，并在室温下搅拌过夜。缓慢滴入含有10% BSA 蛋白的PBS 溶液中，并调节pH 值至7.4。经过0.22 μm滤膜滤过后，得到含有10% BSA 蛋白的20 倍母液（FFA-BSA 8∶1，所有实验组的BSA 蛋白质量分数均控制在0.5%）。使用0.8 mmol/L 浓度的FFA 诱导细胞体外脂肪变性24 h，以建立非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFLD）细胞模型。将细胞分为模型组、对照组以及实验组（分为Cel 和Cel-GlcN 处理组）。经过药物处理48 h 后，弃去细胞上清液，使用PBS 洗涤2 次，然后用200 μL RIPA裂解液破碎细胞。待裂解完全后，取100 μL 裂解液转移至新的EP 管中，使用TC、TG 试剂盒检测细胞中的TC 和TG 含量。剩余的细胞裂解液使用BCA试剂盒进行蛋白定量。

肝脏中脂肪的积聚是导致NAFLD 的一个重要因素，与多种疾病有关。0.6 mmol/L 的FFA 成功诱导了体外高脂细胞模型（如表3 所示）。与对照组相比较，在24 h 内，模型组的TG 含量增加了220%（P＜0.001），TC 含量增加了280%（P＜0.001），二者差异显著，这预示着高血脂模型的成功建立。在对模型组细胞使用不同浓度的Cel 和Cel-GlcN 处理后，实验组的TC 和TG 含量均有不同程度的减少。1 μmol/L 的Cel 在处理FFA 诱导的高脂模型时，相对于模型组，TG 水平显著降低（P＜0.05），但TC含量与模型组没有明显差异。随着Cel 浓度增加，TG 和TC 的含量显著下降（P＜0.05、0.01）。因此，本实验确定2 μmol/L 的Cel 为最低调脂药物浓度。

表3 不同浓度Cel 和Cel-GlcN 干预FFA-HepG2 细胞后TC、TG 含量变化 (±s, n = 4)Table 3 Changes of TC and TG contents of FFA-HepG2 cells after different concentrations of Cel intervention(±s, n = 4)

表3 不同浓度Cel 和Cel-GlcN 干预FFA-HepG2 细胞后TC、TG 含量变化 (±s, n = 4)Table 3 Changes of TC and TG contents of FFA-HepG2 cells after different concentrations of Cel intervention(±s, n = 4)

与对照组比较：###P＜0.001；与FFA 组比较：*P＜0.05 **P＜0.01。###P < 0.001 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs FFA group.

药物 浓度/(μmol·L-1)TG/(μmol·μg-1 protein)TC/(mmol·g-1 protein)对照 - 0.756±0.061 0.061±0.009 FFA - 1.553±0.045### 0.145±0.004###FFA＋Cel 1 1.451±0.036* 0.138±0.008 2 1.252±0.055** 0.126±0.005*4 1.216±0.085** 0.113±0.002**FFA＋Cel-GlcN 1 1.511±0.087 0.141±0.006 2 1.336±0.050** 0.133±0.004*4 1.296±0.075** 0.118±0.003**

根据表3 可以得知，1 μmol/L 的Cel-GlcN 对模型组细胞的血脂水平下降并不显著，但2、4 μmol/L浓度的Cel-GlcN 干预后，总体TG 和TC 水平呈现较小范围的梯度下降，呈现浓度相关性。这也预示着与Cel 相比，Cel-GlcN 在24 h 内对高脂细胞模型组血脂水平的降低程度较低，极可能是由于游离的Cel 没有完全释放，需要更持续的发挥Cel-GlcN 的缓慢释放效果。

2.3.4 细胞内脂滴形态观测 经药物处理后的细胞弃去培养液，经PBS 洗涤2 次后使用4%多聚甲醛固定30 min。除去多聚甲醛后，使用PBS 再次清洗细胞。每孔加入0.5 mL 油红工作液（油红溶于异丙醇制备0.5%的储备液，与蒸馏水以6∶4 的比例混匀后滤过至液体澄清），染色30 min。用60%异丙醇清洗至无明显浮沫后快速晾干。倒置显微镜下观察细胞形态。相比于对照组，高脂模型组的HepG2细胞形态发生了明显的变化，由图7 可知，经FFA处理后的模型组细胞内出现大量的脂滴，且整个细胞形态有变圆的趋势，团聚现象也更加明显，在经过Cel 和Cel-GlcN 进行药物干预后，细胞脂滴逐渐减小，红色区域面积也与Cel-GlcN 的浓度呈剂量依赖性减少，表明Cel、Cel-GlcN 可有效减少细胞内脂滴数量，降低脂肪的沉积程度，同时，随着浓度的增大，细胞表面的脂滴大小及面积也呈现梯度的减少，具有剂量相关性。Cel 或Cel-GlcN 在1、2 μmol/L 的浓度下，Cel 与Cel-GlcN 对于细胞脂滴形态、红色脂滴面积的改善效果并不明显，但随着浓度达到4 μmol/L 时，可观察到Cel 对红色脂滴面积的改善作用更加明显，团聚现象减弱。

图7 Cel、Cel-GlcN 干预后各实验组细胞油红染色细胞图 (×200)Fig. 7 Diagram of oil red stained cells in each experimental group after Cel and Cel-GlcN intervention (× 200)

2.3.5 Cel、Cel-GlcN 对肝脏氧化应激的影响 使用荧光探针DCFH-DA 测定细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）相对含量。将DCF-DA 母液通过DMSO 制备为50 mmol，并使用无血清细胞培养血液DMEM 稀释为10 μmol/L。加入各组细胞后，在37 ℃的培养箱中孵育20 min。使用PBS 清洗2次去除未反应的DCFH-DA 探针。在特定的时间点（1、2、4、8、12、24 h），使用酶标仪读取每个孔在激发波长488 nm、发射波长525 nm 下的荧光强度（fluorescence intensity，F），按公式计算ROS 相对含量。

ROS 相对含量＝(F实验－F空白)/(F对照－F空白)

肥胖是一种多因素引起的慢性疾病。其中，脂肪组织分泌的脂肪因子可以诱导ROS 的产生。当细胞内的ROS 增多而无法及时清除时，就会导致细胞氧化损伤，这被称为氧化应激（oxidative stress，OS），OS 被认为是引发高脂血症等一系列代谢疾病的关键因素[22]。当人体摄入过多的FFA 时，摄入能量远大于消耗的能量，导致原本在线粒体上正常进行的β-氧化部分转化为过氧化物酶体中的β-氧化和内质网上的ω-氧化。这不仅降低了脂肪代谢效率，还会产生更多的ROS，引发机体氧化应激反应。本研究通过对比不同浓度的Cel 和Cel-GlcN 作用于高脂细胞模型后的ROS 水平，其动力学曲线见图8，发现Cel和Cel-GlcN 对细胞内ROS 产生呈现剂量相关性增加。

图8 Cel 及Cel-GlcN 对细胞ROS 产生随时间变化的动力学曲线 (±s, n = 4)Fig. 8 Kinetic curves of Cel and Cel-GlcN on cellular ROS over time (±s, n = 4)

值得注意的是，Cel 在单独作用时同样也会引发细胞内的氧化应激反应[23]，低剂量组1 μmol/L Cel和Cel-GlcN 产生的ROS 水平位于空白组和模型组之间，与FFA 模型组之间差异呈显著性（P＜0.01），表明Cel 和Cel-GlcN 均具有一定抑制机体氧化应激，降低ROS 水平作用，相比于原始药物Cel，Cel-GlcN 能更小程度减弱相关氧化应激反应。推测其可能与Cel-GlcN 释放游离Cel 介导提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅助活化因子1（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC-1）活性相关[24]。在使用2 μmol/L Cel 和Cel-GlcN 处理后，Cel 组的细胞中ROS 水平与FFA 诱导的高脂模型细胞相当，Cel-GlcN 组所产生的ROS水平，与模型组相比较低具有显著性差异（P＜0.05）。经过高浓度组4 μmol/L Cel 和Cel-GlcN 处理后，ROS 水平均高于FFA 模型组（P＜0.01），表明高浓度组的Cel 和Cel-GlcN 所引发的氧化应激反应较模型组更加剧烈，但4 μmol/L Cel-GlcN 相比于同浓度组的Cel，诱发的ROS 水平更低（P＜0.01）。具体结果如表4 所示，因此，体外研究表明，在使用Cel-GlcN 作为药物干预时，不仅可以发挥Cel 和GlcN的调脂、抗炎保肝及抗肿瘤等活性，还可在等浓度条件下减弱由原始药物Cel 诱发的氧化应激反应。

表4 Cel、Cel-GlcN 干预诱导HepG2 细胞24 h 后ROS 含量 (±s, n = 4)Table 4 ROS content in HepG2 cells induced by Cel and Cel-GlcN intervention for 24 h (±s, n = 4)

表4 Cel、Cel-GlcN 干预诱导HepG2 细胞24 h 后ROS 含量 (±s, n = 4)Table 4 ROS content in HepG2 cells induced by Cel and Cel-GlcN intervention for 24 h (±s, n = 4)

与对照组比较：###P＜0.001；与FFA 组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与同剂量Cel 组比较：★★P＜0.01。###P < 0.001 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs FFA group; ★★P <0.01 vs same dose Cel group.

组别 浓度/(μmol·L-1) ROS 相对含量/%对照 - 100.0 FFA - 304.3±16.1###Cel 1 197.3±14.1**2 320.5±10.6 4 378.6±20.0**Cel-GlcN 1 174.3±5.1**2 275.0±15.5*★★4 345.2±15.7**★★

3 讨论

虽然Cel 可以与多个疾病靶点相互作用产生强烈药理学活性，在治疗各种疾病中方面具有巨大潜力，但鉴于其微弱的水溶性（常温下为1.23 μg/mL），较低的生物利用度（SD 大鼠中17%）尤其是对各种器官具有明显的不良反应，Cel 临床应用面对的这些问题也是研究人员重点关注的对象，因而对Cel 进行结构修饰，筛选出药理活性更为突出的衍生物成为了目前研究的热点。

作为一种五环三萜类结构，Cel 具有多个活泼基团，主要包括A/B 环的醌甲基、C-3 位羟基和C-20位羧基，因此，结构修饰大多集中在这些位置。其中，基于第20 位的羧酸基团进行结构修饰，可以通过酰化和酯化反应引入合适的基团从而生成酰胺类、酯类及脲类衍生物。以往对Cel 的酯类衍生物研究中发现，Cel 醌甲基部位为其发挥药理活性的必要部位，一旦改变醌甲基的结构，药物活性就会减弱。单伟光等[23]通过对Cel 第20 位羧酸基团的修饰（添加卤素元素、苯环、六环以及羟基），合成了一系列酯类衍生物（化合物1～10，图9）。这些衍生物中，化合物1～4 和6～8 的极性明显大于Cel，水溶性也更好。其中，化合物4 和8 显示出最强的药物活性，在体外HepG2 细胞实验中表现出最好的效果，这表明羟基的引入可能对Cel 的极性和药理活性有很大改善作用。Zhang 等[24]通过对C-20 羧基修饰后引入胺和三唑类衍生物，发现酰胺键的引入可以提高Cel 的抗增殖活性（化合物11～14）。在哌嗪衍生物类（化合物15～20）中，含氮杂环化合物也同样显示出良好的抗增殖活性，这表明Cel的活性增加可能与引入的含氮基团有关。

图9 Cel 酯类、酰胺类衍生物Fig. 9 Esters and amide derivatives of Cel

GlcN 分子为含氮原子的六元环结构，具有多个羟基，水溶性较好且安全无毒，易于与Cel 分子的活性基团羧基发生酰胺化反应。因此，为降低Cel的药物毒性，本实验选择了GlcN 与Cel 进行酰胺化缩合，在对比2 种不同的反应体系DMF、二氯甲烷后，选择了产率及质量分数均更高的DMF 体系进行小批量酰胺缩合制备Cel-GlcN，相比于Tian 等[11]的研究，该反应无需对Cel 的碳链进行延伸分步与伯胺缩合来实现酰胺化。此外，部分学者为保证酰胺化反应中目标产物的产率，会将羧酸反应为酰氯，经醇淬灭后再与胺反应来提高该反应的效率[25]，本研究方案使用高活性催化剂PyBOP 在DMF 溶剂中完成了该反应，极大地减少了反应副产物生成，同时也保证了具有良好的产率。

肥胖是一种代谢疾病，若不及时干预，可能引发糖尿病、高血压和高血脂症等风险。Cel 作为一种具有多种生物活性的天然产物，在提供显著的减肥功效的同时，其不良反应也是不可忽视的因素。本研究通过对Cel 分子的羧酸基团进行修饰合成了Cel-GlcN 这一衍生物，大大改善了Cel 的溶解性（达到226 μg/mL）。通过比较Cel 和Cel-GlcN 在体外细胞试验中的活性，结果验证了在相同剂量水平下，Cel-GlcN 与Cel 具有相似的减肥调脂活性。此外，Cel-GlcN 可能通过缓控释方式释放游离的Cel，从而减轻其对细胞的毒性和机体内的氧化应激水平。相较于天然产物Cel，Cel-GlcN 很可能减轻其对肝脏、肾脏和心脑血管的不良反应，为Cel 在临床应用上提供了有价值的线索。本研究结果表明，Cel-GlcN 很可能是改善Cel 水溶性和不良反应的重要化合物，并为相关药物的研发提供了参考依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突