威宁鸡 Myf5基因多态性与周龄体重的相关性研究

王文涛, 周武军, 张福平*

(1. 清镇市农业农村局,贵州 清镇 551400;2. 贵州大学动物科学学院,贵州 贵阳 550025)

生肌调节因子又称为生肌决定因子家族,包括4个成员,分别为:生肌决定因子(MyoD)、肌细胞生成素(MyoG)、生肌因子5(Myf5)、生肌因子6(Myf6)[1]。其中Myf5基因是在胚胎发育时肌细胞中最早被诱导表达的因子,决定着肌卫星细胞能否启动具有成肌特性的肌肉干细胞,Myf5基因的表达可促进动物胚胎期肌肉的形成,表现为肌纤维长度、周径增加[2,3]。Myf5基因通过调控成肌细胞肌纤维的数量和大小实现对肌肉生长发育的控制,引起肉量变化[4]。目前,猪、牛、羊的Myf5基因研究较多[5～12],家禽研究较少。研究威宁鸡Myf5基因SNPs以及与体重的相关性,可缩短育种周期,降低育种生产成本,提高经济效益,对威宁鸡的育种工作有重要意义,同时也为威宁鸡种质资源的保护与开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲养管理

同批次初生威宁雏鸡100只(雌、雄各50只)由贵州大学科研鸡场提供,在相同环境条件下标准化饲养至18周龄。

1.2 主要试剂及仪器

主要试剂:血清DNA提取试剂盒(型号:FG0309-A004,北京凡知公司)、DL 2 000 DNA Marker(上海生工生物工程技术服务有限公司)。主要仪器信息见表1。

1.3 方法

1.3.1 体重测定

每2周(初生、2周龄、4周龄、6周龄、8周龄、10周龄、12周龄、14周龄、16周龄、18周龄)称量每只鸡早饲前空腹体重。

1.3.2 血样采集

饲喂至18周龄,翅下静脉采集每只鸡的抗凝血2 mL,-20 ℃保存备用。

1.3.3 DNA 提取

按血清DNA提取试剂盒说明书方法提取血液DNA,-20 ℃保存备用。

1.3.4 引物设计

以NCBI数据库中鸡Myf5基因为参考序列(登录号NC052532.1),使用National Center for Biotechnology Information系统设计2对引物(见表2),用于扩增Myf5基因多态位点区域,引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.5 PCR扩增

分别扩增2段DNA序列,反应体系25 μL:Super PCR Mix 21 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,模板DNA 2 μL。扩增条件:98 ℃预变性2 min,98 ℃变性10 s,57 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,32个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,并送擎科生物有限公司测序。

1.4 数据统计分析

使用SHEsis软件logistics回归法计算威宁鸡群体Myf5基因多态位点的基因型、等位基因频率、纯合度Ho、杂合度He、有效等位基因数Ne、多态性信息含量PIC,用SPSS 21.0软件卡方检验法进行Hardy-Weinberg平衡检验、多态位点配对连锁不平衡分析、基因型与周龄体重关联性分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

由图1可见:Myf5基因片段PCR扩增条带与预期扩增长度相符。

M:DL 2 000 DNA Marker;1、2:片段1;3:片段2

2.2 Myf5基因SNPs多态性分析

由表3可见:威宁鸡Myf5基因存在3个SNPs位点,均位于第一外显子。3个SNPs位点均为错义突变,G.40098586 T>C、G.40098595 T>C 位点的碱基T突变为C,导致氨基酸序列中的终止子突变为精氨酸;G.40098901 A>G位点突变导致赖氨酸(AAG)突变为谷氨酸(GAG)。

2.3 Myf5基因SNPs等位基因分析

由表4可见:Myf5基因SNPs位点的基因频率和基因型频率中,G.40098586 T>C位点的优势基因型TT频率为0.5,优势等位基因T频率为0.692;G.40098595 T>C位点的优势基因型TT频率为0.533,优势等位基因T频率为0.733;G.40098901 A>G位点的优势基因型AG频率为0.467,优势等位基因G频率为0.583。3个突变位点的基因型分布服从Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),均属于中度多态。

2.4 SNPs位点基因型与周龄体重关联性分析

由表5、表6、表7可见:G.40098586 T>C位点的3种基因型对威宁鸡周龄体重无显著影响(P>0.05)。G.40098595 T>C位点各基因型对威宁鸡2、4、6、8、10、12周龄的体重均有影响。其中CC基因型2、8周龄体重极显著高于TT型(P<0.01),CC型6、12周龄体重显著高于TT型(P<0.05),CT型4、10周龄体重显著高于TT型(P<0.05)。G.40098901 A>G 位点的AG基因型4周龄体重显著高于GG型(P<0.01)。

3 讨论

本研究发现威宁鸡Myf5基因的3个突变位点,均位于第一外显子,碱基的突变导致氨基酸序列中的终止子突变为精氨酸,赖氨酸突变为谷氨酸。这与吴淑疆等[11]的研究结果“Myf5基因的突变会导致相关氨基酸的改变”一致。基因型分析显示,Myf5基因的突变位点对威宁鸡周龄体重有一定的影响,但不同的突变位点对不同周龄体重的影响不同,这与马新红[3]的研究结果较一致,即Myf5基因对鸡的早期生长体重有显著影响。相关研究表明,Myf5基因的突变可用作育种标记选择。

4 结论

威宁鸡Myf5基因的3个突变位点均可引起氨基酸序列改变,突变位点与威宁鸡体重显著相关(P<0.05),突变位点G.40098595 T>C、G.40098901 A>G可作为威宁鸡周龄体重选育的分子标记。