补肾活血方对重度宫腔粘连术后患者子宫内膜干细胞标志物的影响*

李曙圆，谭枚秀

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

宫腔粘连又称为Asherman综合征（intrauterine adhesions，IUA），是指子宫内膜基底层因创伤感染等病因受损后，肌层组织暴露导致宫壁相互粘连，影响宫腔正常形态的疾病，严重者将直接影响患者的生育能力[1]。随着医学的发展，宫腔操作人数逐年增多，进一步导致宫腔粘连的发病率上升。目前重度宫腔粘连临床治疗的首选治疗方式是宫腔镜下宫腔粘连电切术（TCRA），但术后的复粘率高。在中医药治疗方面，多项临床试验及动物实验研究证明补肾活血方有抑制粘连的效果[2-4]。近年来多项研究表明子宫内膜干细胞具有向损伤组织趋化和迁移的能力以修复受损内膜组织[5-6]。本研究以重度宫腔粘连术后患者子宫内膜干细胞标志物的表达作为切入点，拟分析补肾活血方与子宫内膜干细胞标志物表达的关系，探讨其对Wnt/β-catenin信号通路的调节机制，并解析其可能的靶向位点，进一步探索宫腔粘连与子宫内膜干细胞的关系。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准 参照《宫腔粘连临床诊疗中国专家共识》[1]和《妇产科学》[7]宫腔粘连的诊断标准：（1）患者常有人流、清宫、刮宫等宫腔操作，以及宫腔感染或有“子宫内膜炎”史，常见月经减少、闭经、周期性腹部疼痛等症状。（2）宫腔镜检查可见宫腔内粘连影像（推荐等级A）；子宫输卵管造影和宫腔声学造影检查可见宫腔变形、体积明显缩小甚至闭锁，宫腔内存在1个或多个不规则、恒定的、缺损性区域，可见造影剂逆流（推荐等级B）。超声及MR检查常表现为宫腔体积缩小或形态不规则，子宫内膜厚度及回声不连续、不均匀，粘连部位的内膜菲薄、基底线不连续，宫腔积液或未见正常宫腔形态等（推荐等级B）。

1.1.2 中医诊断标准 参照《中医妇科临床诊疗指南》[8]和《中医妇科学》[9]中相关内容拟定诊断标准。（1）主症：经量少或经量显著减少，不足1 d或点滴即无，甚至闭经、不孕等；经色淡黯或紫黑，或质稀夹有血块。（2）次症：腰膝酸软、头晕耳鸣、经行腹痛、倦怠乏力、失眠健忘、面色黯淡、眼眶黧黑、性欲减退等。（3）舌脉：舌紫黯，有瘀斑、瘀点，脉细沉或细涩。注：具备主症1项以上，且至少符合2项次症者，结合舌脉象可辨为本病。

1.2 纳入标准 （1）符合美国生育协会（AFS）关于重度宫腔粘连的诊断与分类标准；（2）3个月内无应用激素药物史；（3）年龄18～40岁间（含18岁与40岁），有生育要求者；（4）患者愿意接受试验措施和对照措施（符合伦理学标准），并签署知情同意书，可随访者；（5）术前宫腔镜检查确认子宫无畸形，子宫内膜病理检查正常；（6）术前常规检查及甲状腺功能、卵巢功能无异常；（7）无生殖系统其他合并症。

1.3 排除标准 （1）因卵巢早衰、糖尿病、席汉氏病、甲状腺疾病、肾上腺疾病及垂体肿瘤造成的内分泌失衡；（2）合并肝肾功能障碍、心脏病、血液疾病及精神疾病者；（3）已接受其他类型的药物治疗。

1.4 剔除、脱落标准 （1）未按规定服用药物，或资料不全等无法判定疗效者；（2）资料不全或主动要求放弃治疗者；（3）受试过程中出现过敏反应，或对临床试验所用药物成分过敏者；（4）受试过程中检查发现存在如子宫内膜息肉、子宫内膜不典型增生等生殖器官器质性病变引起的月经不调者；（5）受试过程中对治疗方案依从性差，不能随访者。

1.5 研究对象 选取2021年7月至2022年7月就诊于湖南中医药大学第二附属医院妇科的重度宫腔粘连患者70例，采用随机数字表法分为对照组和治疗组，每组35例。两组患者均接受术前评估，包括年龄、产次、流产史、月经情况及宫腔操作次数，经阴道腔内妇科彩超检查。所有患者均符合纳入标准，且所有入组人员及亲属均对本研究知情，并签订相关同意书。本研究已通过湖南中医药大学第二附属医院伦理委员会审核批准（2023-KY-005）。

1.6 治疗方法 两组患者均完成术前评估，行宫腔镜下宫腔粘连电切术+宫腔三角球囊置入术，术中钳取内膜组织送检，术后均给予抗生素3～5 d预防感染。两组患者均于术后4周、8周复查宫腔镜（月经干净2 d后），了解宫腔形态及粘连情况，若存在粘连，在宫腔镜下钝性分离粘连，恢复其正常宫腔形态，留置三角球囊，并由1名研究人员行AFS评分，术后1周拔除球囊，由同一位医师独立完成。治疗周期完成后行常规宫腔镜检查，钳取内膜送检。

对照组：术后第2天起口服戊酸雌二醇片（商品名：补佳乐；拜耳公司生产；批号：J20130009；规格：1 mg/片），2 mg/次，1次/d，连续服用21 d，第16天起联合服用地屈孕酮片（商品名：达芙通；Abbott Biologicals B.V.荷兰；批号：国药准字H20130110；规格：10 mg/片），10 mg/次，2次/d，待月经来潮第5天开始第2个疗程，若治疗期间月经来潮则停药开始下一周期用药，连续用药3个月经周期。

治疗组：在对照组用药基础上予补肾活血方口服治疗，术后阴道流血干净2 d后连续服用15 d。方药组成：菟丝子20 g，覆盆子15 g，山茱萸20 g，续断10 g，益母草15 g，泽泻10 g，当归10 g，鸡血藤15 g，丹参10 g，炙甘草6 g。15剂，1剂/d，分早晚温服。经期停药，月经干净后2 d后继续服药，连续治疗3个月经期。

1.7 观察指标

1.7.1 AFS评分 记录术前及术后3个月随访的月经情况：月经量较前改善，恢复正常或基本恢复正常；月经量较前无改善，甚至更少或闭经。月经正常为1分，月经减少为2分，无月经为4分。宫腔粘连范围小于1/3为1分，宫腔粘连程度1/3至2/3为2分，宫腔内粘连程度大于2/3为4分。粘连类型中薄膜样为1分，薄膜与致密之间为2分，致密为4分。月经模式中根据子宫粘连的范围、粘连的类型和患者的月经模式，将子宫粘连分为轻度、中度和重度。将上述3个分数相加获得总分，轻度粘连总分1～4分，中度粘连总分5～8分，重度粘连总分9～12分。

1.7.2 子宫内膜标记物 治疗前后钳取子宫内膜，免疫组织化学法检测CD34；Western blotting 法检测ABCG2蛋白的表达；RT-PCR 检测子宫内膜OCT-4基因。

1.7.3 β-catenin蛋白 治疗前后钳取子宫内膜，切片常规脱蜡复水；取3%H2O2溶液使切片浸于其中，室温下孵育后，再用PBS对其进行冲洗；修复抗原后滴加一抗，随后送入4 ℃冰箱内静置过夜；次日将切片拿出，待其回温后，再用PBS对其进行冲洗；滴加二抗孵育后，再用PBS对其进行冲洗；最后依据DAB试剂盒上标明的步骤进行显色操作，持续显色10 min后，对其进行蒸馏水冲洗；进行苏木素复染处理；最后重复上述脱水、透明与烤片操作，封片后再于镜下观片以及采片行免疫组织化学法检测。

1.8 疗效标准[10]治愈：月经量基本恢复至正常水平，宫腔镜下宫腔形态基本恢复正常，未见明显宫腔粘连；有效：月经量较治疗前增多，但仍小于既往正常月经量，宫腔镜下宫腔形态基本恢复正常，仍有少许粘连；无效：月经量无明显改变，宫腔镜下宫腔形态仍失常，甚至宫腔粘连性质或范围较前加重。

1.9 统计学方法 使用SPSS 29.0统计软件进行数据的统计分析。计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，组间比较采用两样本t检验，组内治疗前后比较满足正态分布则采用配对样本t检验，不满足正态分布则采用秩和检验；计数资料用率或构成比表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者失访情况及基线资料比较 治疗过程中共脱落4例患者，对照组脱落1例（患者无法随访），治疗组脱落3例（主动放弃或对治疗方案依从性差）。最终有66例患者纳入统计，对照组34例，治疗组32例。两组患者的年龄、身体质量指数、月经周期、宫腔操作次数等基线资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。（见表1）

表1 两组患者基线资料比较 （±s）

表1 两组患者基线资料比较 （±s）

组别n 年龄/岁 身体质量指数/(kg/m2) 月经周期/d 宫腔操作次数/次对照组 3427.91±6.7822.02±2.8330.20±3.243.45±1.72治疗组 3228.25±7.0222.52±2.7830.85±3.203.05±1.84 t1.5610.8781.2371.056 P0.6250.4240.7130.642

表2 两组患者AFS 评分比较比较 （±s，分）

表2 两组患者AFS 评分比较比较 （±s，分）

组别n治疗前治疗后tP对照组 3410.090±1.1383.150±1.25821.9810.000治疗组 3210.160±1.1942.380±1.10024.5730.000 t-0.2372.647 P 0.8130.010

2.2 两组患者治疗前后AFS评分比较 治疗前，两组患者AFS评分比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组患者治疗后AFS评分均较治疗前下降（P＜0.05）；治疗后治疗组患者AFS评分显著低于对照组（P＜0.05）。

2.3 两组患者治疗前后β-catenin蛋白表达比较 两组患者治疗后β-catenin蛋白表达均较治疗前增加（P＜0.05），且治疗组患者治疗后β-catenin蛋白表达高于对照组（P＜0.05）。（见表3、图1）

图1 β-catenin在子宫内膜干细胞中呈阳性表达（免疫组化，×200）

表3 两组β-catenin 蛋白在子宫内膜干细胞中的表达（±s）

表3 两组β-catenin 蛋白在子宫内膜干细胞中的表达（±s）

组别n治疗前治疗后tP对照组 340.073±0.0070.127±0.002 -41.6530.000治疗组 320.075±0.0060.178±0.003 -75.1470.000 t-1.213-76.883 P 0.2300.000

2.4 两组患者治疗前后CD34蛋白表达比较 两组患者治疗后CD34蛋白表达均较治疗前增加（P＜0.01），且治疗组患者治疗后CD34蛋白表达高于对照组（P＜0.01）。（见表4、图2）

图2 CD34 在子宫内膜干细胞中呈阳性表达（免疫组化，×400）

表4 两组患者CD34 蛋白在子宫内膜干细胞中的表达比较（±s）

表4 两组患者CD34 蛋白在子宫内膜干细胞中的表达比较（±s）

组别n治疗前治疗后tP对照组 3434.25±0.7240.21±0.92 -24.4810.000治疗组 3235.57±1.0446.74±2.24 -31.7020.000 t-1.861-15.650 P 0.0960.000

2.5 两组患者治疗前后ABCG2蛋白表达比较 两组患者治疗后ABCG2蛋白表达均较治疗前增加（P＜0.05），且治疗组患者治疗后ABCG2蛋白表达高于对照组（P＜0.01）。（见表5、图3）

图3 ABCG2 蛋白表达Western blotting 图

表5 两组患者ABCG2 蛋白相对表达量比较（±s）

表5 两组患者ABCG2 蛋白相对表达量比较（±s）

组别n治疗前治疗后tP对照组 340.29±0.130.35±0.08-2.2960.028治疗组 320.31±0.091.09±0.12 -27.7480.000 t-0.773-29.656 P 0.4430.000

2.6 两组患者治疗前后Oct-4基因表达比较 两组患者治疗后Oct-4基因表达量均较治疗前增加（P＜0.01），且治疗组患者治疗后Oct-4基因表达量高于对照组（P＜0.01）。（见表6）

表6 两组患者Oct-4 基因相对表达量RQ 值比较 （±s）

表6 两组患者Oct-4 基因相对表达量RQ 值比较 （±s）

组别n治疗前治疗后tP对照组 340.30±0.050.54±0.17 -8.6860.000治疗组 320.32±0.071.03±0.19 -20.0080.000 t-1.467-10.993 P 0.1470.000

熔解曲线均在80～90 ℃之间出现唯一单峰，扩增曲线基线期平整，指数期明显，曲线整体平滑，重复性好。（见图4～5）

图4 Oct-4 的扩增曲线（左）和溶解曲线（右）

图5 β-actin 的扩增曲线（左）和溶解曲线（右）

2.7 不良反应 在随访期间，对照组乳房胀痛病例数量为5例，其中既往乳房胀痛病史2例。治疗组乳房胀痛病例数量为3例，其中既往乳房胀痛病史1例；无患者对补肾活血方有过敏反应。用药期间，所有患者的肝功能均正常，两组患者均未报告凝血功能异常及血栓形成。

3 讨论

本研究基于前期临床研究基础，以重度宫腔粘连术后患者子宫内膜情况与子宫内膜干细胞标志物的表达为方向，拟分析补肾活血方与子宫内膜干细胞改变的关系，期望给临床合治疗方案提供用药参考。

宫腔操作属于金刃伤及胞宫，气血生化失常，血行无力，以致肾-天癸-冲任-胞宫轴紊乱，常表现为月经量少或闭经。现代医家通过探讨络脉、络病学理论，为其临床辨治提供了新思路[11-12]。基本病机以虚、瘀为主，病性以虚实夹杂为多，病位多在冲任、胞宫。刘倩等[13]研究发现，宫腔粘连性质改变时，中医病机与证型演变具有趋向性。其中重度者多见肾虚血瘀证，而临床重度宫腔粘连亦常辨证为肾虚血瘀证。有研究[14]对宫腔粘连中医药治疗的数据分析得出，当代中医治疗宫腔粘连多以补血活血、滋肾益精药物为基本组方配伍，也侧面验证临床宫腔粘连证型多为肾虚血瘀证。本方君以菟丝子温补肾阳、填补肾精，配合山茱萸补益肝肾；臣以覆盆子补肾固精、续断甘温助阳，配益母草、当归、鸡血藤、丹参活血化瘀、通络调经之功效；佐以泽泻泄胞宫之浊；使以炙甘草调和诸药[15]。临床中本方常用于改善月经情况及调理孕前体质等。本研究结果表明，治疗组患者AFS评分反映的子宫内膜情况及月经恢复情况优于对照组。

本研究基于前期补肾活血方的临床疗效观察[16]，进一步观察了重度宫腔粘连术后患者在补肾活血方作用后，子宫内膜干细胞标志物的表达情况，以及治疗过程中是否存在激活Wnt/β-catenin信号通路的可能性。王英等[17]研究表明补肾活血序贯法联合雌二醇用药可改善子宫内膜容受性。而多项研究表明，ABCG2阳性细胞存在于整个功能层和基底层，可作为子宫内膜干细胞的标记物[18-19]。Oct-4基因在子宫内膜中高表达[20]，与CD34蛋白均为干细胞的重要标记物[21]。而国内外多项研究表明β-catenin蛋白是Wnt途径的核心成分，是Wnt/βcatenin信号通路最为关键和核心的信号转导因子[22]。子宫内膜干细胞又与子宫内膜修复息息相关[23]。故本次研究通过子宫内膜干细胞标记物CD34蛋白、ABCG2蛋白及0CT4基因的表达来鉴定子宫内膜干细胞的表达，同时检测β-catenin蛋白，验证Wnt途径是否激活。结果表明，两组患者治疗后CD34蛋白、ABCG2蛋白及Oct-4基因阳性表现均高于治疗前，且治疗组标志物表达水平及表达率均高于对照组，表明加用补肾活血方疗效更佳，可提高子宫内膜干细胞表达。同时，β-catenin蛋白在子宫内膜干细胞呈阳性表达，且与标志物存在正相关作用。多项研究表明Wnt/β-catenin通路在肝脏再生修复、保护损伤肺组织及干细胞分化中被激活[24-25]。本研究设想补肾活血方预防重度宫腔粘连再粘可能的机制如下：补肾活血方可通过提高β-catenin蛋白表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，促进子宫内膜干细胞的增殖分化，抑制子宫内膜纤维化进程，达到治疗目的。补肾活血方可通过Wnt/β-catenin通路作用于子宫内膜干细胞的具体机制，则有待在更具体的实践中研究。

本研究的不足之处主要有两方面：一是未能采取随机对照研究的双盲原则，即给予对照组与试验组同等外形、颜色、重量的赋形剂作为安慰剂对照，按时揭盲；二是评估月经量主要通过患者主观叙述，如果能用血红蛋白测量法或月经失血图评估月经量，可以提高研究结果的可靠性。

综上所述，补肾活血方可以明显改善重度宫腔粘连术后患者子宫内膜状态，增加β-catenin蛋白、CD34蛋白、ABCG2蛋白及Oct-4基因的表达，促进子宫内膜干细胞的增殖分化，同时可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响子宫内膜干细胞标志物的表达，治疗宫腔粘连。