基于液质联用技术分析磨盘草石油醚部位在大鼠血浆中的成分*

李 健，陶志娟，张 靓

（张家港市中医院，江苏苏州 215699）

磨盘草为锦葵科苘麻属植物磨盘草[Abtilon indicum (L.)Sweet]的全草。其曾收载于《广西本草选编》《生草药性备要》《全国中草药汇编》等文献。磨盘草生于道路、旷野及路旁，主要分布于广东、福建、云南、广西等地[1-3]。磨盘草具有疏风清热、益气通窍和祛痰利尿的作用，常用于治疗流行性腮腺炎、感冒高烧不退、耳鸣、疝气痈肿、淋病等。为了更合理有效地利用药材，对磨盘草吸收入血的有效成分物质的研究显得尤为重要。目前国内对磨盘草的研究较少，研究主要集中在生药鉴别和少许的成分分析[4-6]，而国外的研究多见于其有效物质成分对应的临床诊疗研究。国内外相关研究已经确定了磨盘草石油醚部位提取物具有良好的利尿效果[7-10]。在其特征图谱的研究[11]基础上，本研究为了更加清楚地说明磨盘草石油醚部位药用物质基础，利用UPLC-MS技术深层次分析磨盘草石油醚部位及实验动物的含药血浆，旨在进一步阐明临床药用机制。

1 材料

1.1 药物与试剂 磨盘草中药饮片（批号：20220313）购自苏州市天灵中药饮片有限公司。磨盘草中药饮片10 kg，先打成黄豆粒样粗粉，用95%的乙醇进行加热回流提取，得617 g浸膏。浸膏再用60～90 ℃的石油醚萃取，回收石油醚溶液，得到113 g石油醚部位浸膏，加入吐温80后用蒸馏水配成每1 g石油醚部位含有66 g生药。冰醋酸（批号：20220603）购自国药集团化学试剂有限公司；磷酸（批号：20211118）购自成都市科隆化工试剂厂；色谱纯乙腈（批号：20220918）购自Fisher控制设备国际有限公司。

1.2 实验动物 6～8周龄SPF级SD雄性大鼠8只，体质量200～250 g，由苏州西山中科药物研究开发有限公司提供，动物许可证号：SYXK（苏）2021-0048，检疫合格证：2022063125478SK。整个实验过程中普通饮食、自由饮水，常规条件饲养，饲养室温为20～25 ℃，湿度为50%～60%。本实验经江苏省中医院动物伦理委员会审批许可，伦理号：2022DW-06-06。

1.3 主要仪器 PH010A型电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；TGL-16M型台式低速自动平衡离心机（上海手术器械厂）；101A-3E型电热鼓风干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）；B3500S-MT型超声波清洗器（上海必能信公司）；LG16-W型高速低温离心机（Heraeus科技有限公司）；MDF-C8V（N）型超低温冰箱（三洋电机株式会社）；XEVO G2-S QTOF液质联用仪（美国Waters公司）；Waters Acquity BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（美国Waters公司）。

2 方法

2.1 血清的采集与处理 8只SD大鼠随机分成空白组和给药组，每组4只。给药组大鼠每天给予120 mg/kg的磨盘草石油醚部位，空白组大鼠给予等体积生理盐水灌胃，1次/d，连续10 d。第11天灌胃给药后，分别于30、60、90、120、150 min用眼眶取血法取血，置于肝素钠试管中，5000 r/min（半径为12 cm）离心10 min，连续2次，分离血浆后于-80 ℃保存。

精密移取各时间段（30、60、90、120、150 min）的离心血浆50 μL，置于2 mL离心管中，按1∶8的比例加入50 mmol/L有机溶剂（NH4Ac-ACN，1 ∶6）800 μL。室温振荡10 min，4 ℃，12000 r/min（离心半径为12 cm）离心10 min，吸取上清液37 ℃氮气吹干；样品加入流动相20 μL充分溶解后，4 ℃，12000 r/min（离心半径为12 cm）离心10 min，吸取上清液。

2.2 液质条件[12-15]液相条件：流速为0.4 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为2 μL，流动相为0.1%的磷酸（A）和乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序见表1，共运行15 min。质谱条件：载气为He，电离方式为ESI，正离子检测，离子源温度为100 ℃，碰撞能量为6 V，毛细管电压为2.8 kV，质量扫描范围为100～1500 aum。

表1 梯度洗脱条件

3 结果

按“2.2”项下试验条件进样，依次得到样品、空白血浆和给药各时间段血浆的总离子流图。（见图1～2）为了进一步确定其物质组成，在60 min血浆里进行了各保留时间与样品离子流图的比对研究，结果发现在3.62、3.77、4.69、4.90、5.74 min这5个时间点里出现了磨盘草石油醚部位的入血成分。为了确定其元素组成，本研究进行了5个时间点的质谱图分析。（见图3～12、表2）

图1 空白血浆和各时间段给药血浆总离子流图

图2 空白血浆、60 min 血浆和磨盘草石油醚部位样品总离子流对比图

图3 3.62 min 入血成分与磨盘草石油醚部位样品对比图

图4 3.62 min 入血成分质谱图

图5 3.77 min 入血成分与磨盘草石油醚部位样品对比图

图6 3.77 min 入血成分质谱图

图7 4.69 min 入血成分与磨盘草石油醚部位样品对比图

图8 4.69 min 入血成分质谱图

图9 4.92 min 入血成分与磨盘草石油醚部位样品对比图

图10 4.92 min 入血成分质谱图

图11 5.74 min 入血成分与磨盘草石油醚部位样品对比图

图12 5.74 min 入血成分质谱图

表2 吸收入血化合物的高分辨质谱数据及元素组成

4 讨论

4.1 5种入血物质的成分推断[16-19]本研究通过液质联用技术对磨盘草石油醚部位体外成分与大鼠血中移行成分进行比较，发现5个共同成分，可能为药液直接吸收入血的成分；在血中移行未发现的成分，可能已发生代谢或者生成了其他的产物。经查找国内外相关文献，本研究发现了与前4种化合物相同分子式的相关物质研究，3.62 min出现的C25H52NO9、3.77 min出现的C19H32N2O7归类为葡萄糖苷酸类化合物。其不同的配基体现不同的药理作用，以抗炎、镇痛、利尿和抗心衰等药理作用多见。4.69 min出现的C18H37NO归属鞘脂类化合物，是生物膜的重要组成成分，可参与调节细胞的生长、分化、衰老和细胞程序性死亡等许多重要的信号转导过程。4.92 min出现的C19H39O4为非离子表面活性剂类，可能是石油醚部位灌胃时为了增加药物的溶解性，加入的助溶剂在体内代谢的产物。而5.74 min最后在血浆中出现的化合物C32H39O7是磨盘草石油醚部位液相特征图谱中含量最高的一种物质，其分子式比环氧千金-二萜醇-二乙酰苯乙酰少一个氧原子。此物质对人体肠道有刺激作用，在临床上主要用于治疗人体内外的炎症，也佐证了磨盘草在临床使用上具有的抗炎作用。

4.2 液质联用在中药血清/浆中的药物研究的意义[20-21]液质联用技术（LC-MS）始于20世纪70年代，经过近半个世纪的技术完善，形成了多种联用技术接口，但是直到大气压化学离子化技术接口的成熟，液质联用才得到广泛的应用。目前最常见是四级杆质谱仪。其优点除灵敏度高、操作简便和节约试验成本外，还具有可以进行蛋白质、多肽、核酸的分子量确认，以及氨基酸和碱基对的序列测定及翻译后的修饰等工作。而中药本身成分复杂，分离提纯难度大。其进入体内后，被吸收进入血液。要想了解体内中药物质（代谢产生新的成分、直接吸收入血成分、化学成分被分解后再次吸收成分）体内代谢情况，就必须建立从口服中药后血清中直接分离鉴定中药药效物质基础并研究其药代动力学特性的新方法。本研究正是运用了UPLC-MS技术，鉴别了磨盘草石油醚部位在大鼠血中移行成分，不仅得到了分离度良好的色谱峰，还基本确定了该部位在动物体内的代谢时间范围，节省了试验试剂的消耗，为进一步研究磨盘草石油醚部位有效成分奠定了基础。