一款含泰束胶原蛋白肽功效护肤品在面部抗老化方面的研究进展

吴黎明 吴田田 王长明 张婷婷 赵磊 石梅玲 邓志宏

1 西安博和医疗科技有限公司 （陕西 西安 710032）

2 陕西佰傲再生医学有限公司 （陕西 西安 710032）

3 博鸿生物技术（苏州）有限公司 （江苏 苏州 215500）

4 西安博鸿生物技术有限公司 （陕西 西安 710032）

5 陕西佰辰生物科技有限公司 （陕西 西安 710032）

6 西安组织工程与再生医学研究所 （陕西 西安 710032）

内容提要： 目的：通过体外及人体联合测试方法，评价一款含泰束胶原蛋白肽护肤品的安全性及抗皱、紧致等功效方向的抗老化研究进展。方法：通过利用培养成纤维细胞，运用ELISA方法检测Ⅰ型胶原蛋白、弹力蛋白含量及第三方人体功效实验室进行人体功效检测，分别在0周、2周、4周采集分析皱纹、皮肤水分含量、经皮水分流失率、弹性等数据，综合评估本品的抗老化方面的研究进展。结果：①基于成纤维细胞，与对照组相比，样品在0.3125%浓度下，弹性蛋白与Ⅰ型胶原蛋白分泌量均呈现极显著升高趋势（P＜0.001）。②31名经乳酸刺痛试验筛选入组的敏感肌志愿者使用产品28d后与使用产品前相比，皮肤角质层水分含量、皮肤经表皮失水率、皮肤弹性R7值、皮肤紧致F4、外眼角处皱纹（长度、数量）均有显著性改善。结论：含泰束胶原蛋白肽抗皱精华对面部皮肤老化引起的皮肤干燥、粗糙和皱纹有一定的改善作用，并具有良好的安全性。

皮肤老化是影响面部年轻化的重要原因，而紫外线照射又是外源性皮肤老化的关键因素，长期接触紫外线的皮肤表现为粗糙、皱纹加深、失去弹性，伴有色素沉着[1]。随着人们生活水平日益提高，越来越多的人们开始追求拥有健康、年轻的皮肤状态。而泰束胶原蛋白肽是纳米级纯化学合成仿生人源Ⅰ型胶原蛋白，拥有Gly-Pro-Hyp胶原特征序列最多的肽段，富含约超过35%羟脯氨酸含量，比市面上大多数胶原蛋白中羟脯氨酸高13%，且分子量2000Da，可有效渗入皮肤角质层，发挥抗皱功效[2,3]。本研究通过研究泰束胶原蛋白肽对Ⅰ型胶原蛋白、弹力蛋白含量合成的影响，观察该活性原料用于人体后的功效表现，以期获知基于泰束胶原蛋白肽作为核心活性原料在产品配方中体外和人体安全性及功效性研究数据，判断其是否具有改善皮肤干燥、粗糙和皱纹方面的功效作用。

1.资料与方法

1.1 临床资料

研究起止时间：2022年8月～2022年9月。

选取上海地区通过乳酸刺痛试验筛选入组的31名敏感皮肤志愿者，其中，女性22名，男性9名，年龄30～60岁，平均（43.71±8.46）岁。纳入标准：面部有轻度皮肤老化表现（干燥、细纹、弹性下降和皱纹等）；自愿参加本试验，签署知情同意书，按要求使用产品并完成随访；近2个月内没有参加任何涉及皮肤的临床试验。排除标准：测试部位有皮肤疾病者；处于怀孕期，哺乳期，备孕期；经研究者判断为不适合参加者。

主要仪器与试剂：CO2培养箱（Thermo，150i）、超净工作台（苏州安泰，SW-CJ-1F）、酶标仪（BioTek，Epoch）、倒置显微镜（Olympus，CKX41）、长波紫外线照射仪（博溪生物）、Antera 3D（芬兰Delfin）、Cutometer MPA580（德国CK）、Corneometer CM825（德国CK）、Tewameter™Hex（德国CK）；低糖DMEM培养基（博溪生物）、PBS（博士德）、新生牛血清（NBS，兰州荣晔）、MTT（Sigma）、Elastin ELISA试剂盒（Abcam）、Collagen I ELISA试剂盒（Abcam）、转化生长因子-β1（Peprotech）、泰束胶原蛋白肽精华液（商品名：绽媄娅紧致淡纹精华液，陕G妆网备字2022000964，批号220701）。

1.2 方法

1.2.1 体外测试方法

细胞毒性测试：按8×103个/孔的接种密度接种成纤维细胞至96孔板，培养箱（37°C，5% CO2）中孵育过夜。待96孔板中细胞铺板率达到40%～60%时进行给药。溶剂对照组每孔加入200μL 10%二甲基亚砜（DMSO）培养液；调零组无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液；样品组共设置8个浓度梯度，依次每孔加入200μL 0.0781%，0.1563%，0.3125%，0.6250%，1.25%，2.5%，5%，10%（V/V）的泰束胶原蛋白肽精华液；以上三组均放置在培养箱中培养24h，且每个样品共设置3个重复孔。培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液（0.5mg/mL），37°C避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。利用细胞相对活力(%)=(样品孔OD-调零孔OD)/(溶剂对照组OD-调零孔OD)×100%公式计算细胞相对活力。当相对细胞活力≥80%，认为受试物在该浓度下无细胞毒性。

体外功效测试：按2.2×105个/孔的接种密度接种成纤维细胞至6孔板，培养箱（37°C，5% CO2）中孵育过夜；待6孔板中细胞铺板率达到40%～60%时，进行分组给药，每孔加样2mL，每组设3个复孔。给药完成后将6孔板放置在培养箱（37°C，5% CO2）中继续培养24h。按照30J/cm2辐照剂量对细胞进行长波紫外线辐照，继续放入培养箱（37°C，5% CO2）中培养24h后，收集细胞培养上清液于离心管中，根据Ⅰ型胶原蛋白、弹力蛋白ELISA试剂盒的操作说明书进行检测[4-7]。仅为成纤维细胞培养组作为空白对照组，增加UVA辐照条件的为阴性对照组，辐照后，使用TGF-β1作为阳性刺激对照物，促进1型胶原蛋白和弹性蛋白增长的为阳性对照组。

1.2.2 人体测试方法

按照每日早晚洁面后各使用1次，每次根据使用习惯量取适量产品，均匀涂抹于面部，轻轻按摩至吸收，连续使用28d。使用Antera 3D（芬兰Delfin）和Cutometer MPA580（德国CK）检测使用前，使用后14d 和28d 随机一侧外眼角区域皱纹长度、皱纹数量；皮肤弹性参数R7值和皮肤紧致参数F4值；同时使用Corneometer CM825（德国CK）和Tewameter™Hex（德国CK）检测相同时间点受试者皮肤角质层水分含量和经皮水分流失率。

测试结束后，受试者需完成主观自我评估问卷。

测试环境及要求：受试者清洁面部，并用无屑干面巾纸擦干皮肤，在温度（21±2）°C，湿度50%±10%的检测室中静坐平衡30min。各检测指标面部区域标记点如图1所示。

图1.面部检测位点标记

1.3 统计学分析

数据使用SPSS 28.0统计学软件进行数据分析，计量资料以±s表示，若测试数据符合正态分布，则采用配对t检验方法；若测试数据为非正态分布，则采用秩和检验，P＜0.05表示为差异有显著性意义。

2.结果

2.1 体外安全性测试结果

根据MTT和形态学结果，认为样品基于成纤维细胞，在0.3125%的浓度范围内未表现出明显的细胞毒性，见图2、图3。故使用该浓度进行体外功效测试。

图2.不同浓度梯度样品MTT结果

图3.不同浓度梯度样品形态学

2.2 体外功效性测试结果

2.2.1 Ⅰ型胶原蛋白含量的测试结果

皮肤中胶原蛋白主要由85%～90%Ⅰ型胶原蛋白及10%～15%Ⅲ型胶原蛋白构成[8]。因此，通过检测样品提升Ⅰ型胶原蛋白含量有助于说明待测样品的抗皱功效，故开展体外检测Ⅰ型胶原蛋白含量试验。

与阴性对照组相比，阳性对照组（转化生长因子-β1）的Ⅰ型胶原蛋白含量分泌水平呈极显著升高趋势（P＜0.001），而试验组Ⅰ型胶原蛋白分泌量也具有极显著升高趋势（P＜0.001），且提升率达70.60%，见表1。

表1.Ⅰ型胶原蛋白含量检测结果汇总表(±s,ng/mL)

表1.Ⅰ型胶原蛋白含量检测结果汇总表(±s,ng/mL)

样品名称平均浓度P空白对照组56.45±1.20-阴性对照组42.61±3.00＜0.01阳性对照组115.66±6.46＜0.001试验组72.69±1.78＜0.001

2.2.2 弹力蛋白含量的测试结果

弹力蛋白（Elastin）是构成弹性纤维的主要蛋白质，含量降低，导致弹性纤维变稀疏，皮肤弹性降低。因此本研究以成纤维细胞为研究模型，采用长波紫外线照射建立体外光老化模型，通过检测弹力蛋白含量的变化来说明待测样品的紧致功效。

与阴性对照组相比，阳性对照组（转化生长因子-β1）弹力蛋白分泌水平有显著升高（P＜0.01），而试验组弹力蛋白分泌量极显著升高（P＜0.001），提升率为63.90%，见表2。

表2.弹力蛋白含量检测结果汇总表(±s,ng/mL)

表2.弹力蛋白含量检测结果汇总表(±s,ng/mL)

样品名称平均浓度P空白对照组483.30±26.84-阴性对照组150.41±2.55＜0.001阳性对照组445.40±19.72＜0.01试验组246.52±15.69＜0.001

2.2.3 人体功效测试结果

皮肤角质层水分含量测试结果显示，与0周相比，皮肤角质层含水量在2周和4周均呈现升高趋势（P＜0.001），说明测试产品具有良好的保湿效果[9,10]；皮肤经皮水分流失率测试结果显示，与0周相比，皮肤经皮水分流失值在2周和4周均呈现下降趋势（P＜0.001），说明测试产品具有良好的修护皮肤屏障效果，以上结果见表3[11,12]。

表3.不同周期面部角质层水分含量和经表皮水分流失值检测结果(n=31,±s)

表3.不同周期面部角质层水分含量和经表皮水分流失值检测结果(n=31,±s)

注：aP＜0.01，bP＜0.001

检测指标0周2周4周水分含量(a.u.)41.90±13.36 51.87±10.84ab 53.23±10.49ab经表皮水分流失值(g/h/m2)20.05±4.41 17.68±3.11ab 16.77±2.50ab

皮肤弹性及紧致度测试结果显示，与皮肤弹性相关的参数R7值2周与0周相比有明显升高趋势（P＜0.01），4周与0周相比升高趋势更明显（P＜0.001）；F4值4周与0周相比有降低趋势（P＜0.01），见表4。

表4.不同周期面部弹性及紧致度检测结果(n=31,±s)

表4.不同周期面部弹性及紧致度检测结果(n=31,±s)

注：aP＜0.01，bP＜0.001

检测指标0周2周4周R7 0.466±0.07 0.500±0.07a 0.521±0.09ab F4 0.466±0.07 0.500±0.07 0.521±0.09a

R7代表胶原含量，越高越好；F4代表皮肤紧致度，数值变小，说明皮肤越紧致[13]。R7和F4结果说明本测试产品具有良好的紧致功效。皮肤皱纹测试结果显示，与皮肤皱纹相关的参数皱纹长度2周和4周与0周相比均有显著变短趋势（P＜0.001）；皱纹数量2周与0周相比显著减少（P＜0.01），4周与0周相比减少趋势更明显（P＜0.001），说明本测试产品具有良好的抗皱效果，见表5。

表5.不同周期面部皱纹相关参数(n=31,±s)

表5.不同周期面部皱纹相关参数(n=31,±s)

注：aP＜0.01，bP＜0.001

检测指标0周2周4周皱纹长度(mm)34.06±26.99 25.38±22.30ab 22.76±21.18ab皱纹数量(n)4.81±2.97 3.81±2.60a 3.16±2.45ab

通过Antera 3D拍摄受试者单侧外眼角照片可明显发现受试者局部眼周皱纹长度及数量有明显改善，见图4。

图4.部分受试者局部眼周皱纹变化效果

受试者主观自我评估问卷平均满意度达到86.22%，见表6。

表6.受试者自我满意度评估结果(n=31)

3.讨论

据国内外文献研究报道，胶原蛋白可以起到滋润肌肤的作用，同时补充皮肤所需氨基酸，修护受损肌肤，除此之外，胶原蛋白的成膜特性还可以减少经表皮水分流失。因此，胶原蛋白由于其保湿、再生和成膜的特性，被常用于面膜、眼霜、面霜等化妆品配方中，甚至保健食品、口腔护理、头皮护理等领域[2]。另外胶原蛋白肽与皮肤角质层结构的相似性决定了它与皮肤良好的相容性、良好亲和力和渗透性，能渗透入皮肤表皮层，被皮肤充分吸收，并在皮肤表面形成一层极薄的膜层，从而使皮肤丰满、皱纹舒展，同时提高皮肤密度增加，产生张力，达到抗皱效果[14]。据报道来自罗非鱼鱼鳞水解胶原蛋白的体外试验发现，罗非鱼鱼鳞水解胶原蛋白能够刺激成纤维细胞的生长，加速原胶原纤维的合成，且呈一定的时间和剂量相关性[15]。马慧敏等[16]通过体外及人体研究结果发现，含水解胶原蛋白眼霜可以促进成纤维细胞增殖；与基础值相比，在第1、4周时，该眼霜可以显著地增加皮肤角质层的含水量，并改善眼周皱纹。印大中等[17]发明了一种龟皮胶原组合物的护肤品，发现其达到很好的祛斑、防皱、保湿功能。Proksch等[18,19]开展的两次双盲随机对照研究中，口服8周胶原蛋白肽干预，与安慰剂组相比，胶原蛋白肽剂量组的受试者皮肤弹性显著改善，眼睛皱纹体积显著减少（20%），Ⅰ型胶原蛋白（65%）和弹性蛋白（18%）显著增加，对真皮基质合成有积极作用。另外多项动物实验研究显示，胶原蛋白肽干预可以显著增加皮肤羟脯氨酸和胶原蛋白含量，促进皮肤新生胶原的形成，使Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的比例正常化，并可显著增强皮肤中的抗氧化酶活性，进而改善皮肤松弛程度[20-22]。

本研究采用体外模型及人体功效相结合方法，综合评估含泰束胶原蛋白肽精华作用于面部皮肤抗老化方面功效。基于体外长波紫外线刺激下成纤维细胞模型试验得出，测试产品能极显著性提升Ⅰ型胶原蛋白、弹力蛋白含量（P＜0.001）；基于31名敏感肌的受试者连续使用测试产品28d后，受试者皮肤角质层水分含量、皮肤经表皮失水率、皮肤弹性R7值、皮肤紧致F4、外眼角处皱纹（长度、数量）均有显著性改善。结合以上研究数据表明，测试产品具有高效的保湿、修护、紧致、抗皱功效。

综上所述，含有泰束胶原蛋白肽的精华对面部皮肤老化引起的皮肤干燥、粗糙和皱纹有一定的改善作用，具有良好的抗老化功效和安全性，以泰束胶原蛋白肽为原料的功效护肤品具有广泛的应用前景。