21 种中药提取物体外抗菌活性研究

李金鸽，胡丞丞，付培蕾，冯 爽，李 珂，2，李文渊，2*

1.郑州工业应用技术学院药学与化学工程学院，河南 郑州 450000；2.郑州工业应用技术学院河南省水环境与健康工程技术研究中心，河南 郑州 450000

细菌感染一直是威胁人类生命健康的潜在危险因素，每年都会造成千百万人感染疾病甚至死亡[1-2]。自1928 年青霉素被发现并广泛应用于细菌感染治疗以来，人类细菌感染性疾病的发病率和死亡率便大大降低了[3-4]。由于人们对抗生素认知不足和滥用，导致许多细菌产生了耐药性，致使抗生素的治疗功效急剧下降，甚至引发了一系列不良反应。世界卫生组织（WHO）已将细菌耐药性列为一个重要的公共卫生问题[3-5]。因此，寻找安全有效、不易产生耐药性、不良反应少的抗菌药物是当前亟需解决的问题。

中药常常被用于疾病的控制和预防，具有来源广、毒副作用少等特点。中药抗菌是“后抗生时代”对抗细菌耐药现象的有效措施。近年来，人们对中药抗菌的研究日渐增多，魏要武等[6]通过对25 种中药进行对比研究，发现丁香、石榴皮、绿茶三种中药提取物的抗痤疮功效最明显。柳香香等[7]研究发现甘草中的甘草甜素对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，抗菌效果较好。江丽等[8]从金银花和甘草等20 种中草药中筛选出了抗菌活性显著的五味中药，分别是大黄、黄芩、甘草、牡丹皮和金银花。进一步的研究表明，中药主要是通过影响其细胞膜、蛋白质及核酸等组分的稳定性，来改变其细胞壁的结构和功能，从而达到抑菌效果的。因此，筛选具有抗菌活性的中药可以为研发新的抗菌药物提供理论依据[9-10]。本实验选取了21 种中药提取物分别研究了金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌等的抑菌效果，为开发治疗细菌感染性疾病的“中药抗生素”提供了参考。

1 材料

1.1 材料

金银花、苦地丁、红景天、大黄、黄连、黄芩、黄柏、厚朴、决明子、麻黄、丁香、广藿香、女贞子、绵马贯众、板蓝根、甘草、大青叶、鱼腥草、连翘、桔梗、秦皮，共计21 种，均来自安徽亳州，药材由郑州工业应用技术学院李珂副教授鉴定。

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌BNCC186335、枯草芽孢杆菌FSCC115037、铜绿假单胞菌GDMCCI443、大肠杆菌ATCC25922 由河南省水环境与健康工程技术研究中心天然产物实验室提供。

1.3 主要仪器

LDZF-75KB-II 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、LHS-CL 恒温恒湿箱（上海一恒科学仪器有限公司）、SW-CJ 型超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）、ReadMax1900Plus 光吸收酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）等。

1.4 主要试剂

乙醇、二甲亚砜（DMSO）分别购自天津科密欧化学试剂有限公司、天津市富宇精细化工有限公司，本实验所用到的化学试剂均为分析纯。LB 培养基的成分胰蛋白胨、NaCl、酵母提取物购于北京鸿润宝顺科技有限公司，琼脂粉购于广东环凯微生物科技有限公司。

2 方法

2.1 中药提取物的制备

称取10 g 中药材粗粉于100 mL 80%乙醇中浸泡30 min，回流提取两次，时间为70 min，合并滤液。将滤液浓缩至5 mL，放入烘箱中烘干为浸膏。将干燥后的中药浸膏溶于1 mLDMSO，配制成质量浓度为10.24 mg/mL 药品供试液。

2.2 菌液的制备

将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌分别接种于LB 固体培养基上，置于37 °C 的恒温恒湿培养箱中培养24 h（枯草芽孢杆菌的培养温度设置为28 °C），刮下菌苔，接入10 mL液体培养基，放入摇床培养（150 r/min）。24 h 后，取1 mL 用LB 液体培养基稀释10 000 倍备用。

2.3 药材活性的筛选

取无菌96 孔板平底微量培养板，每孔加入10 μL 药液、90 μL LB 培养基和100 μL 稀释后的菌液，每相邻3 孔为1 组平行对照，设置空白对照组（纯菌液），放入35.5 ℃恒温恒湿培养箱中静置培养24 h，用光吸收酶标仪测量其625 nm 下的吸光度（OD）值，初步记录初始浓度下提取物的抗菌活性。

2.4 二倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）

取无菌96 孔平底微量培养板，在A 行每孔中加入10 μL 中药提取物母液和190 μLLB 液体培养基，充分混匀。B 至F 行每孔加入100 μLLB 液体培养基，吸取100 μLA 行孔内培养液至对应的B 行孔，充分混匀；再吸取100 μLB 行孔内培养液至对应的C 行孔，充分混匀，依次操作，直至F 行。最后各孔均加入100 μL 稀释后的菌液，混匀。阳性对照组为含1%相应抗生素的菌悬液，空白对照组为200 μLLB 液体培养基。将96 孔培养板置于35 °C 恒湿恒温箱中培养24 h 观察结果，用光吸收长酶标仪（625 nm）测定吸光度，计算其MIC 值。

2.5 数据处理

3 结果

3.1 21 种中药乙醇粗提物体外抗菌活性测定结果

通过设置阴性对照与空白对照，分别测试21 种中药乙醇提取物（初始质量浓度10.24 mg/mL 对不同菌种的抑菌活性），结果如表1 所示。

表1 21 种中药提取物对不同菌种的抗菌活性测定

3.2 MIC 测定结果

根据抗菌活性测定结果，筛选出具有抗菌活性的中药提取物，用二倍稀释法测定其MIC，其结果见表2-5。金银花、红景天、大黄、黄连、黄柏、厚朴、麻黄、丁香、广藿香、女贞子、绵马贯众、板蓝根、甘草的乙醇提取物对金黄色葡萄球菌具有显著的抑制作用，其MIC 值分别为0.84 mg/mL、5.16 mg/mL、2.91 mg/mL、7.01 mg/mL、5.86 mg/mL、1.13 mg/mL、11.42 mg/mL、14.92 mg/mL、12.82 mg/mL、12.97 mg/mL、11.21 mg/mL、4.27 mg/mL、3.62 mg/mL。其他8 种中药的乙醇提取物对金黄色葡萄球菌无明显抑制活性。金银花、黄柏、厚朴、板蓝根、甘草、大青叶、桔梗、秦皮对枯草芽孢杆菌的MIC 值分别为11.32 mg/mL、6.51 mg/mL、10.18 mg/mL、11.32 mg/mL、13.01 mg/mL、17.96 mg/mL、6.92 mg/mL、4.27 mg/mL；其他13种中药的乙醇提取物对枯草芽孢杆菌无明显抑制抗菌活性。桔梗、秦皮对铜绿假单胞菌的MIC 值均大于20 mg/mL，表明这两种中药乙醇提取物对铜绿假单胞菌的抗菌活性较弱，但其他19 种中药乙醇提取物均无抗菌活性。金银花、桔梗对大肠杆菌的MIC值分别为8.80 mg/mL、18.69 mg/mL，表明金银花乙醇提取物对大肠杆菌的抗菌活性比桔梗乙醇提取物好，而其它19 种中药乙醇提取物均没有抗菌活性。

表2 13 种中药提取物对金黄色葡萄球菌的MIC值测定

表3 8 种中药提取物对枯草芽孢杆菌的MIC 值测定

表4 2 种中药提取物对铜绿假单胞菌的MIC 值测定

表5 2 种中药提取物对大肠杆菌的MIC 值测定

4 讨论

近年来，人们发现一些中药及其活性成分提取物对细菌及病原微生物具有较强的抑制作用。中药化学成分复杂且抑菌机理多样化，如中药可以影响微生物细胞膜、蛋白质及核酸等组分的稳定性，取得抑菌效果。我们应发挥中医药理论的优势特色，利用现代科学技术研究中药的化学成分及其理化性质，阐明中药的抗菌机制，为耐药菌药物的研发和创制提供思路。

本实验选取的21 种中草药乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌分别表现出了不同程度的抗菌效果。从实验统计结果可以看出，金银花、板蓝根、甘草、桔梗的乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用均很强；红景天、大黄、黄柏、厚朴的乙醇提取物对金黄色葡萄球菌也有明显的抑制作用，秦皮乙醇提取物对枯草芽孢杆菌也有一定的抑制作用。桔梗、秦皮的乙醇提取物对铜绿假单胞菌有抑制作用，金银花、桔梗乙醇提取物对大肠杆菌也有抑制作用。

研究结果表明，金银花对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑菌效果，金银花乙醇提取物对革兰氏阳性菌的MIC 比对革兰氏阴性菌的MIC 强10 倍左右，提示其对革兰氏阳性菌和阴性菌的作用机制可能不同。该研究为进一步探究金银花乙醇提取物的抑菌成分及其作用机制奠定了基础。