磁改性D151阳离子交换树脂纯化黄柏小檗碱*

武佳盈，侯梦梦，冯浩恩，张翠利

(黄河科技学院，河南 郑州 450063)

黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，习称“川黄柏”[1]。黄柏的主要化学成分为黄酮类和生物碱类，其中生物碱是黄柏的主要有效成分，且含量最高[2]。黄柏生物碱中的小檗碱(Berberine)，属于异喹啉生物碱，应用最广，是黄柏活性成份中最有价值的单体[3]，具有多种药理作用，包括抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤、心脏保护、降血糖、调节脂质代谢以及免疫抑制等[4-7]。另外张莉和吕晓楠等证明黄柏提取物对食品和水果的腐败菌也有很好的抑制作用[8-11]。

目前小檗碱的纯化方法有溶剂法、大孔吸附树脂法和离子交换树脂法等[12-13]，这些方法有的需要大量有机溶剂，造成环境污染；有的需要装柱、上样、洗脱及检测等步骤，操作繁琐。磁改性的离子交换树脂是一种磁性高并且较稳定的磁性材料，由于其骨架中含有无机磁性组分，可加速沉降分离，提高操作效率[14-16]，可用于天然产物有效成分的富集和纯化，操作简单高效。同时无机磁性组分可能存在与小檗碱作用的活性位点，能提高吸附率。

目前关于磁改性的离子交换树脂用于黄柏中小檗碱的纯化还未见报道。本研究以小檗碱吸附率为指标，考察了磁性D151阳离子交换树脂纯化黄柏中小檗碱的工艺研究，为黄柏生物碱的精制工艺提供依据。

1 仪器与试剂

FA1004型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)、T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、丹瑞HH-2数显恒温水浴锅(金坛市双捷实验仪器厂)、JJ-1增力电动搅拌器(上海梅香仪器有限公司)、电炉(上海树立仪器仪表有限公司)。

黄柏(安徽亳州)、大孔弱酸性阳离子交换树脂D151(国家高新技术企业)、乙醇(烟台市双双化工有限公司)、硫酸(洛阳市化学试剂厂)、盐酸(洛阳昊华化学试剂有限公司)、氢氧化钠(天津市科郑州派尼化学试剂厂)、甲苯(洛阳市化学试剂厂)、乙醚(烟台市双双化工有限公司)、FeCl3·6H2O(密欧化学试剂有限公司)、FeCl2·4H2O(天津市光复精细化工研究所)、盐酸小檗碱对照品(批号：110713)，以上试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 小檗碱母液的制备

采用醇提法对黄柏中小檗碱进行提取[17]。称取干燥黄柏粉末 20 g，置于 500 mL 圆底烧瓶中，加入7倍体积70%乙醇，加热回流 1.5 h，提取2次，过滤，合并滤液。将滤液浓缩至无醇味，浓缩液中加入硫酸，使硫酸质量分数为0.5%，过滤。将滤液定量转移至 250 mL 的容量瓶中，用0.5%H2SO4定容，制得小檗碱母液(pH值约为3)。

2.2 盐酸小檗碱标准曲线的绘制

精密称取盐酸小檗碱对照品 2.5 mg，置 50 mL 的容量瓶中，用质量分数0.5%硫酸溶液溶解，并用质量分数0.5%硫酸稀释定容得 0.25 mg/mL 对照品储备液。精密吸取贮备液 1、3、5、7、10 mL，分别置于 100 mL 容量瓶中，用质量分数0.5%硫酸溶液定容至刻度线，在 421 nm 波长处测定各溶液的吸光度(A)值。 以吸光度 (A)值为纵坐标，小檗碱质量浓度 (mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程A=13.04C+0.04 (R2=0.999)，小檗碱质量浓度为 0.0025 mg/mL～0.025 mg/mL 范围内与吸光度线性关系良好。结果见图1。

图1 小檗碱的标准曲线

2.3 树脂的预处理

取D151阳离子交换树脂 5 g，置干燥的 250 mL 锥形瓶中，加入约5倍树脂量的无水乙醇浸泡 1 h，弃去浸泡液，用蒸馏水冲洗至无醇味，再用5%的盐酸溶液 20 mL 浸泡 1 d 后用蒸馏水冲洗至中性，最后用4%NaOH溶液 20 mL 浸泡 1 d，蒸馏水冲洗至中性，备用[18]。

2.4 磁性D151阳离子交换树脂的制备

目前，磁性阳离子交换树脂的制备方法主要用化学共沉淀法，单体聚合法和化学转化法等[19-20]。本实验采用化学共沉淀法来制备磁性阳离子交换树脂。将 0.1 mol/L 的FeCl3·6H2O溶液 33 mL、0.1 mol/L 的FeCl2·4H2O溶液 66 mL、预处理过的树脂 5 g、蒸馏水 20 mL 分别置于氮气保护的三颈瓶中，在 50 ℃ 水浴的条件下，以 600 r/min 的搅拌速度搅拌 5 min，缓慢滴加浓度为 1 mol/L 的氢氧化钠溶液，至混合液pH为8，并继续搅拌 1.5 h。将反应液转移到烧杯中，反复用蒸馏水清洗至无色，再用乙醇清洗3次，低温下干燥得磁性D151阳离子交换树脂，备用。

2.5 磁性交换树脂对小檗碱的吸附及吸附率的测定方法

称取制备的磁性树脂 5 g，分别置于 250 mL 锥形瓶中，精密量取小檗碱母液 25 mL 置于锥形瓶中，每 30 min 振摇 1 min，在不同条件下进行吸附、过滤得滤液。紫外分光光度法分别测定滤液和母液的吸光度A，代入标准曲线计算出母液中小檗碱的浓度(C0)和吸附后滤液中小檗碱的浓度(C1)，计算树脂对小檗碱的吸附率(%)，计算公式见公式(1)：

吸附率(%)=(C0-C1)×100%/母液浓度

(1)

2.6 单因素试验

以磁性树脂对小檗碱的吸附率为考察指标，通过单因素试验考察小檗碱初始质量浓度(0.0025、0.005、0.01、0.015、0.02 mg/mL)、溶液pH值(2、4、6、8、10)、吸附时间(1、1.5、2、2.5、3 h)、吸附温度(15、25、35、45、55 ℃)这几个因素，考察各因素对吸附率的影响。

3 结果与分析

3.1 小檗碱初始浓度对吸附率的影响

称取制备的磁性树脂 5 g 5份，置于5个 250 mL 锥形瓶中，分别精密量取pH值为4的小檗碱母液 25 mL(质量浓度分别为 0.0025、0.005、0.01、0.015、0.02 mg/mL 五个水平)置于锥形瓶中，在 35 ℃ 条件下吸附 2 h。采用2.5项下的方法测定不同浓度下磁性树脂的吸附率，结果见图2。

图2 小檗碱初始质量浓度对吸附率的影响

由图2可知，母液质量浓度小于 0.015 mg/mL 时，随着母液浓度增大，磁性树脂吸附小檗碱的能力增加。母液质量浓度大于 0.015 mg/mL 时，随着浓度的增大，磁性树脂对小檗碱的吸附率略降低。当母液质量浓度为 0.015 mg/mL 时，吸附率达到最高91.05%。

3.2 pH值对吸附率的影响

称取制备的磁性树脂 5 g 5份，置于5个 250 mL 锥形瓶中，再分别精密量取用硫酸或氢氧化钠调节的pH值分为2、4、6、8、10的 0.015 mg/mL 小檗碱母液 25 mL，置于锥形瓶中，在 35 ℃ 条件下吸附 2 h。采用2.5项下的方法测定不同pH值下磁性树脂的吸附率，结果见图3。

图3 pH值对吸附率的影响

由图3可知，pH值为6时，磁性树脂对小檗碱的吸附能力最强，吸附率达90.54%。pH值小于6时，吸附率随着溶液pH值的增大而增加。pH值大于6时，随着pH值的增大，吸附率随之下降。

3.3 吸附时间对吸附率的影响

称取制备的磁性树脂 5 g 5份，置于5个 250 mL 锥形瓶中，再分别精密量取pH值为6的 0.015 mg/mL 小檗碱母液 25 mL，置于锥形瓶中，在 35 ℃ 条件下进行吸附，吸附时间分为 1、1.5、2、2.5、3 h 5个水平。采用2.5项下的方法测定不同吸附时间下磁性树脂的吸附率，结果见图4。

图4 时间对吸附率的影响

由图4可知，吸附时间低于 2.5 h 时，对小檗碱的吸附率随着时间增长而升高。时间超过 2.5 h 时，吸附率下降，时间为 2.5 h 时，树脂的吸附率高达90.52%。

3.4 温度对磁性D151阳离子交换树脂吸附小檗碱的影响

称取制备的磁性树脂 5 g 5份，置于5个 250 mL 锥形瓶中，再分别精密量取pH值为6的 0.015 mg/mL 小檗碱母液 25 mL，置于锥形瓶中，在不同温度(15、25、35、45、55 ℃ 五个水平)下进行吸附 2 h。采用2.5项下的方法测定不同吸附温度下磁性树脂的吸附率，结果见图5。

图5 温度对吸附率的影响

由图5可知，吸附率随着吸附温度的增加而不断上升，在 35 ℃ 时达到最佳，吸附率为90.53%，之后随着温度的增加而吸附率下降。由图中可以看出温度过高或者过低时，都会影响磁性树脂对小檗碱的吸附。

3.5 正交试验

在单因素试验的基础上，用正交试验对吸附因素(母液浓度、pH值、时间、温度)进行优化，按照表1正交试验设计L9(34)测定磁性树脂对小檗碱的吸附，正交结果及方差分析见表2和表3。

表1 正交试验设计L9(34)

表2 正交试验直观分析

表3 方差分析

根据表2中数据的分析可知，A2B3C2D2为磁性树脂对小檗碱的最佳吸附条件，即母液的质量浓度为 0.015 mg/mL、pH值8、吸附时间 2.5 h、吸附温度为 35 ℃。由极差分析可知，吸附因素对吸附率影响大小依次为：母液的浓度>吸附时间>吸附温度>pH值。

3.6 小檗碱的洗脱

取吸附小檗碱的磁性树脂，使用蒸馏水反复冲洗，直到洗液为无色为止。然后精密量取70%乙醇溶液 25 mL 进行浸泡洗脱，之后每隔 30 min 振摇 1 min，2.5 h 后用紫外分光光度计测定洗脱液的吸光度A，并代入标准曲线计洗脱液中小檗碱的浓度C2，按公式(2)计算解吸附率(洗脱率)。

洗脱率%=[C2/(C-C1)]×100%

(2)

注：公式(2)中，C为小檗碱母液的浓度，C1为磁性树脂吸附后滤液中小檗碱的浓度，C2为洗脱液中小檗碱的浓度。

4 验证性试验

称取制备的磁性树脂 5 g，3份，置于3个 250 mL 锥形瓶中，在上述最佳条件下进行小檗碱的吸附，分别精密量取pH值为8的 0.015 mg/mL 小檗碱母液 25 mL，置于锥形瓶中，在 35 ℃ 条件下每隔 30 min 振摇 1 min，每分钟振摇30次，2.5 h 后过滤，用紫外分光光度计测定滤液中小檗碱的浓度。然后取用上述吸附过小檗碱的磁性树脂，使用蒸馏水反复冲洗，直到洗液为无色为止。精密量取70%乙醇溶液 25 mL 进行洗脱，每隔 30 min 振摇 1 min，2.5 h 后计算测定出洗脱液中小檗碱的浓度，按照公式(1)和公式(2)分别计算吸附率和洗脱率，结果见表4，由结果可知该方法结果准确可靠。

表4 磁性树脂对小檗碱的吸附率与洗脱率

5 结论

通过单因素和正交试验确定了磁性树脂对小檗碱的最佳吸附参数，当小檗碱的母液质量浓度为 0.015 mg/mL，溶液的pH值为8、吸附时间 2.5 h、吸附温度为 35 ℃ 时，磁性D151阳离子交换树脂对小檗碱具有最佳的吸附能力。吸附率高达91.11%，较未磁化树脂吸附率85.76%有一定的提高，可能为磁化时生成的Fe3O4对小檗碱也存在一定的吸附位点。所以，磁性离子交换树脂较离子交换树脂具有分离快速、吸附率高、易解吸附、操作简单等优点，在天然产物活性纯化方面具有较好的应用前景。