双氢青蒿素通过诱导自噬抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖

张丹，张昊，何俐

0 引言

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是头颈部常见的恶性肿瘤之一，全球每年有超过30万例的OSCC新发病例，超过14万例患者死于OSCC[1]。目前，化疗仍是控制口腔癌远处转移、改善预后的重要辅助手段之一，但化疗耐药是口腔癌生存率无明显改善的原因之一。降低化学药物的毒副作用、克服肿瘤细胞耐药、是口腔癌临床诊疗亟待解决的问题，新药研发或药物再利用已成为OSCC治疗领域的主要研究方向。双氢青蒿素（dihydroartemisinin, DHA）是菊科植物黄花蒿的生物活性成分，具有抗疟、抗炎、抗内毒素、免疫调节等多种药理学作用[2]。近年来，DHA的抗肿瘤性能得到关注，越来越多的证据证实了DHA的抗肿瘤特性。在口腔癌中，Chen等研究发现DHA通过预防M2巨噬细胞极化和阻断STAT3磷酸化，对头颈部鳞状细胞癌的侵袭、迁移和血管生成均有抑制作用[3-5]。然而目前相关的研究较少，DHA对于口腔癌具体的抗癌机制和作用靶点仍有待进一步探索。本实验将探究DHA对口腔鳞状细胞癌CAL27细胞增殖能力的影响及其可能机制，为其将来应用于口腔鳞癌治疗提供一定的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人口腔鳞癌细胞株CAL27购于湖南丰晖生物科技有限公司。高糖培养基DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶购于美国Hyclone公司。双氢青蒿素、3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine, 3-MA）、雷帕霉素（Rapamycin, RAPA）购于上海麦克林生物科技有限公司。Anti-PCNA、Anti-Beclin-1、Anti-LC3B/MAP1LC3B和Anti-β-actin均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将CAL27细胞置于含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 CCK-8法检测CAL27细胞的增殖 将CAL27细胞（8×103个/孔）接种于96孔板中，用指定浓度的DHA（0、25、50、100、200 μmol/L）处理细胞。DHA分别干预24 h和48 h后，加入CCK-8试剂，检测吸光度，计算各组细胞增殖抑制率及24 h的IC50值。后续实验分为六组：DHA组、3-MA组、DHA +3-MA组、RAPA组、DHA+RAPA组和空白对照组。

1.2.3 平板集落实验 将对数生长期的细胞以1 000个/孔接种于6孔板中培养12 h，DHA处理。每4 d更换1次培养基，连续培养14 d。弃去原培养液，用PBS洗涤2次。随后，用预冷的4%多聚甲醛固定细胞15 min，瑞氏-姬姆萨染色5 min。在显微镜下计数各组CAL27细胞（大于50个细胞）集落数。集落形成率=集落数/接种细胞数×100%。

1.2.4 免疫印迹法 不同浓度DHA作用于CAL27细胞，37℃培养箱培养24 h后，收集细胞，用PBS洗涤至少2次，并用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解。收集上清液进行免疫印迹检测。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h后，膜与特定一抗在4℃孵育过夜。TBST洗膜三次，辣根过氧化物酶标记抗兔或抗鼠抗体室温孵育2 h。然后TBST清洗膜三次，并使用ChemiDocTMMP成像系统和增强化学发光检测试剂盒获取图像。

1.2.5 网络药理学结合生物信息学分析 将源自PubChem在线平台的双氢青蒿素2D结构提交到Swiss Target Prediction数据库，预测DHA作用靶点；利用GeneCards数据库和OMIM数据库对人类基因组的数据进行注释，以 “oral squamous cell carcinoma”为关键词检索OSCC相关基因，与DHA作用的靶基因进行比对，最终筛选获得DHA与OSCC相关的交集靶点并构建PPI网络对每个节点的边数相加，预测PPI网络中的核心基因。最后，利用OSCC和DHA的交集靶点进行功能富集和通路分析。

1.3 统计学方法

用SPSS20.0统计分析软件对数据进行处理，所有数据以（±s）表示，多样本间比较采用单因素方差分析One-way ANOVA，两组间比较采用独立样本t检验。实验至少均独立重复三次。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双氢青蒿素对OSCC细胞增殖的影响

在同一时间段内，随着DHA药物浓度的升高，DHA对CAL27细胞的抑制率也在不断升高。根据结果计算得出DHA处理CAL27细胞的24 h和48 h的IC50值分别为148.3 μmol/L和123.7 μmol/L，两者差异无统计学意义（P＞0.05）。根据24 h的IC50值设置实验组DHA浓度为148.3 μmol/L。平板集落实验结果显示：与空白对照组比较，DHA（25、50、100、200 μmol/L）组CAL27细胞的集落形成数均显著降低（P＜0.0001），见图1。结果表明，DHA可以抑制CAL27细胞的增殖活性。

图1 CCK-8法和平板集落实验法检测DHA对CAL27细胞增殖调控作用Figure 1 Inhibitory effect of DHA on proliferation of CAL27 cells determined by CCK-8 and plate colony assays

2.2 通过网络药理学寻找OSCC中潜在的DHA靶点

利用公共数据库探索OSCC中潜在的DHA靶点，分别收集了6 962个人OSCC靶基因和369个DHA的药物靶点，取交集后，获得了287个共有靶基因（图请扫描本文OSID码），将其导入到字符串构建PPI网络，通过对一个节点的边数相加，ALB、AKT1和EGFR等被鉴定为参与该通路的前30个核心基因。DHA和OSCC共同靶点的GO和KEGG分析为了确定相关的途径和功能，富集的生物特性过程、细胞成分和分子功能的靶蛋白，主要与激酶活性、肌细胞增殖、蛋白有关激酶活性等相关。此外，KEGG分析显示这些靶点主要富集信号通路中前10位包括PI3K-AKT信号通路、FoXO信号通路等，其中PI3K/Akt通路在自噬活性的调节中起着关键作用。

2.3 双氢青蒿素诱导口腔鳞状细胞癌细胞自噬抑制增殖

不同浓度DHA（25、50、100、200 μmol/L）处理CAL27细胞24 h后收集蛋白。与空白对照组相比，DHA处理后，增殖相关蛋白PCNA表达水平降低，而自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ和Beclin-1表达水平明显上调，差异有统计学意义（均P＜0.001），见图2。

图2 Western blot法检测DHA对CAL27细胞增殖和自噬相关蛋白的表达Figure 2 Western blot detection of effect of DHA on expression of proliferation- and autophagy-related proteins in CAL27 cells

2.4 自噬阻断剂3-MA逆转DHA诱导的自噬效应

Western blot结果显示，与空白对照组比较，DHA组（148.3 μmol/L）CAL27细胞内PCNA蛋白表达水平降低（P=0.000007），而自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表达水平明显上调（P=0.035528和P＜0.0001）。与DHA组（148.3 μmol/L)比较， DHA+3-MA组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1表达水平明显下降（P=0.002993,P=0.000623），而PCNA表达水平明显上调（P=0.037551），见图3。表明自噬阻断剂3-MA在一定程度上通过阻断双氢青蒿素诱导口腔鳞状细胞癌细胞自噬拮抗对细胞活力的增殖抑制效应。

图3 蛋白免疫印迹法检测3-MA和RAPA联合DHA对CAL27细胞增殖和自噬相关蛋白表达的调控作用Figure 3 Western blot analysis of effect of 3-MA and RAPA combined with DHA on expression of proliferation- and autophagy-related proteins in CAL27 cells

2.5 自噬阻断剂3-MA逆转DHA导致的细胞增殖抑制

CCK-8检测结果显示，与空白对照组比较，DHA组（148.3 μmol/L）CAL27细胞的存活率和集落形成数明显下降（P＜0.0001）。而与DHA组（148.3 μmol/L）比较，DHA+3-MA组细胞的存活率和集落形成数明显上调（P＜0.05），见图4。表明自噬阻断剂3-MA在一定程度上恢复了DHA抑制的CAL27细胞活性。结果表明DHA通过诱导自噬抑制细胞生长。

图4 CCK-8法(A) 和平板集落实验法(B, C)检测3-MA和RAPA联合DHA对CAL27细胞增殖调控作用Figure 4 Regulatory effect of 3-MA and RAPA combined with DHA on proliferation of CAL 27 cells determined by CCK-8(A) and plate colony assays(B, C)

3 讨论

双氢青蒿素是青蒿素的主要活性代谢产物，是一种一线抗疟疾药物。虽然已有较多研究证实DHA对多种实体瘤可发挥抗癌作用[6-9]，但其对OSCC的抗肿瘤作用目前相关报道较少。基于此，本研究首先通过CCK-8试验筛选出DHA的浓度范围，并进一步通过CCK-8和平板克隆形成实验，发现DHA可以明显抑制CAL27细胞的增殖活力和克隆形成能力，且具有良好浓度依赖性。先前的研究表明，DHA在抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞死亡方面的作用在各种实验模型中已有报道，但其潜在的分子机制尚不清楚[10-12]。基于此，本研究对其抑制增殖的机制进行了初步探索。

本研究构建了DHA和OSCC的共同靶点网络，并通过GO和KEGG分析了其主要基因的功能。其中，AKT1、MAPK3是重要的靶点，而PI3K/AKT信号通路是重要的信号通路。PI3K/Akt通路被认为是分解代谢过程中的重要参与者，在自噬活性的调节中起着关键作用[13-15]。自噬是一个复杂的细胞过程，细胞降解衰老的和有缺陷的细胞成分，以满足其代谢需求[16]。在正常的生理条件下，自噬的基础水平对于维持细胞内稳态、发育和代谢平衡至关重要。自噬失调与许多病理学疾病有关，如神经退行性疾病、感染性疾病和癌症[17-19]。

基于以上网络药理学结合生物信息学的筛选结果，本研究进一步探索DHA抗口腔癌细胞增殖的可能自噬机制。当用梯度浓度的DHA干预CAL27后，细胞中增殖相关蛋白PCNA的表达减少，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的表达量显著增多，说明DHA处理可诱导口腔癌细胞中自噬的发生。为了验证自噬是否进一步抑制增殖，本研究利用3-MA和RAPA增强或阻断DHA诱导的自噬，通过CCK-8和平板克隆实验检测细胞增殖活力，Western blot检测自噬及增殖相关蛋白指标的变化。研究发现，与DHA组相比，DHA和3-MA联合处理组中自噬相关蛋白Beclin-1的表达和LC3-Ⅱ转化水平均降低，而DHA和3-MA联合使用的细胞反映出更高的细胞活性。以上结果表明，自噬抑制剂可逆转双氢青蒿素诱导的细胞自噬进而导致增殖抑制。

综上所述，本研究基于网络药理学结合生物信息学通过体外实验对DHA在口腔癌中的抗癌作用进行了探索。数据表明，DHA可以抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖，可能与通过诱导自噬相关，其在口腔癌治疗方面具有一定的潜力，然而，目前相关的研究仍较少，未来仍需要进一步的研究来揭示DHA的抗癌性能及机制，为其实现临床应用提供证据。

利益冲突声明：

所有作者均声明不存在利益冲突。