不同分子量牛蒡多糖的生物活性研究

王解语，滕迎弟，唐业豪，黄莉莉， 巫永华，2，张建萍，2，刘恩岐，2

（1.徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏徐州 221018；2.徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏徐州 221018）

牛蒡（Arctium lappa L.）为菊科牛蒡属两年生草本植物，是传统药食同源的植物，多糖类是牛蒡中具有重要生理活性的物质之一，且含量较高。对于牛蒡多糖的提取和生物活性的研究已经有大量的报道，吕俊梅等人[1]优化了微波法提取牛蒡多糖的工艺；唐仕荣等人[2]采用超声波法制备了牛蒡多糖，且表明其具有一定的清除DPPH·和·OH 的能力；李玲玉等人[3]也优化了超声辅助提取牛蒡多糖的工艺，并对其体外和细胞内的抗氧化活性进行了评价；张辰辰等人[4]优化了绿色高效的动态高压微射流工艺提取牛蒡多糖，分析表明牛蒡根多糖为呋喃型多糖，并具有较好的清除DPPH·、·OH 和ABTS+·的能力；课题组也考查了双水相[5]和闪式提取[6]制备牛蒡多糖的工艺及其抗氧化活性。但牛蒡多糖组成较为复杂，研究表明多糖的生物活性与其相对分子量大小有关[7]，Ling Shi-kuan 等人[8]研究发现，相对分子质量越小的多糖，其抗氧化性越强；赵婷婷[9]也研究表明分子量对坛紫菜多糖生物活性影响很大，分子量越低其体外抗氧化活性和免疫调节作用越显著。此外，李彩艺等人[10]研究双参多糖和朱晓冉等人[11]研究黑木耳多糖时也得出相似的结论。而有关不同分子量牛蒡多糖生物活性的研究较少，采用超滤技术获得不同分子量段的牛蒡多糖，并对其抗氧化、降血糖和胆酸盐结合能力等生物活性进行研究，为其进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛蒡，购自农贸市场。

没食子酸、芦丁、D -半乳糖醛酸、葡萄糖、福林酚、1,1 -二苯基-2 -三硝基苯肼（DPPH），上海叶源生物科技公司提供；苯酚、无水乙醇、浓硫酸，国药集团上海试剂公司提供。所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MILLIPORE 小型切向流超滤系统，默克生物科技有限公司产品；BGZ-76 型电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司产品；ALPHA1-4 LD plus 型冷冻干燥机，德国CHRIST 仪器公司产品；TU-1810 型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司产品；BioTek Synergy2 型多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 牛蒡多糖的制备

将鲜牛蒡根洗净、切片，采用质量分数为1.5%的柠檬酸溶液浸泡2～3 min，捞出沥水后，于50 ℃鼓风干燥箱中烘干，粉碎后过80 目筛，冷藏备用。取一定量的牛蒡粉，加入5 倍体积的体积分数为95%的乙醇溶液浸泡2 h，重复3 次。将药渣置于50 ℃烘箱中烘干，按料液比1∶30（g∶mL）加入纯水，于85 ℃条件下提取3 h 后过滤，滤液浓缩至1/10 后加入无水乙醇至其体积分数为80%，于4 ℃条件下静置12 h。将沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤3 次去除色素等杂质。用去离子水完全溶解粗多糖，将Sevage 试剂（正丁醇∶氯仿=1∶4）与多糖溶液按1∶4 的比例混匀，搅拌60 min 以脱除蛋白质，多糖溶液冷冻干燥后获得牛蒡多糖，放入自封袋中，于-20 ℃下保存备用。

1.3.2 不同分子量牛蒡多糖的制备

取一定量的上述牛蒡多糖，用纯水溶解后，采用MILLIPORE 小型切向流超滤系统，分别通过5，8，30，50，300 k 的超滤膜，在0.05 MPa 条件下超滤、浓缩、冷冻干燥，获得不同分子量段的牛蒡多糖。

1.3.3 牛蒡多糖的生物活性研究

（1）DPPH·清除率的测定。参照姚芳等人[12]的方法，于波长517 nm 处测定吸光度，按照公式（1）计算DPPH·清除率。

式中：A1——牛蒡多糖样品溶液与DPPH 混合液的吸光度；

A2——牛蒡多糖样品溶液和乙醇混合液的吸光度；

A0——乙醇和DPPH 混合液的吸光度。

（2）·O2-清除率的测定。参照何芳等人[7]的邻苯三酚自氧化法，测其于波长325 nm 处的吸光度，按照公式（2）计算·OH 清除率。

式中：A0——邻苯三酚自氧化吸光度；

A1——加入牛蒡多糖溶液后的邻苯三酚自氧化吸光度。

（3）α -淀粉酶抑制率的测定。参考汤陈鹏等人[13]的方法测定牛蒡多糖抑制α -淀粉酶的活性，测其于波长540 nm 处的吸光度。按照公式（3）计算α -淀粉酶的抑制率。

式中：A0——纯水替换牛蒡多糖溶液测定的吸光度；

A1——牛蒡多糖溶液测定的吸光度；

A2——磷酸盐缓冲液替换α -淀粉酶溶液测定的吸光度；

A3——纯和磷酸盐缓冲液分别替换牛蒡多糖溶液和α -淀粉酶溶液测定的吸光度。

（4）α -葡萄糖苷酶抑制率的测定。参考李婧雯等人[14]的方法测定牛蒡多糖抑制α -葡萄糖苷酶的活性，采用多功能酶标仪测其在405 nm 波长处的吸光度，按照公式（4）计算α -葡萄糖苷酶的抑制率。

式中：A——牛蒡多糖溶液测定的吸光度；

A1——磷酸缓冲液替换α -葡萄糖苷酶测定的吸光度；

A2——磷酸缓冲液替换牛蒡多糖测定的吸光度。

（5）体外胆酸盐结合能力测定。参照于美汇等人[15]的方法，以甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠为标准品，测其于波长387 nm 处的吸光度，分别获得标准曲线。再根据文献报道的方法测定并计算牛蒡多糖对甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合能力。

2 结果与分析

2.1 不同分子量牛蒡多糖的分布

不同分子量牛蒡多糖分布见图1。

图1 不同分子量牛蒡多糖分布

由图1 可知，牛蒡多糖通过不同超滤膜分离后，分子量＜5 k 的牛蒡多糖占5.24%，5～8 k 占12.13%，而＞300 k 的占22.41%，显著高于前者，但是与30～50 k 和50～300 k 的没有差异；分子量大于30 k 的多糖占64.17%，表明牛蒡多糖主要由分子量大于30 k的多糖组成；试验中同时发现不同分子量段的牛蒡多糖颜色也会有一定的差异，分子量越大，多糖粉末的颜色越深。

2.2 牛蒡多糖生物活性研究结果

2.2.1 牛蒡多糖的抗氧化活性

（1）DPPH·清除能力

清除DPPH 自由基的效果见图2。

图2 清除DPPH 自由基的效果

由图2 可知，不同分子量段的牛蒡多糖为0.5～1.0 mg/mL 时，清除DPPH·能力随多糖质量浓度的升高而升高，与喻俊等人[16]的研究结果相似，表明牛蒡多糖具有较好的DPPH·清除能力。根据回归曲线计算其IC50值，其中＜5 k 组分的为0.99 mg/mL，5～8 k组分的为0.82 mg/mL，8～30 k 组分的为0.96 mg/mL，30～50 k 组分的IC50值为0.95 mg/mL，而50～300 k 和＞300 k 的组分在试验溶度范围内无法计算其IC50值，但其在质量浓度为1 mg/mL 时，清除率仅有40.18%和36.90%，表明分子量为5～8 k 的牛蒡多糖对DPPH·的清除率效果最好。

（2）·O2-清除能力

清除羟自由基的效果见图3。

图3 清除羟自由基的效果

考查样品对·O2-的清除能力时体现样品抗氧化活性的重要指标，由图3 可知，在1.0～1.8 mg/mL 质量浓度范围内，不同分子量段的牛蒡多糖对·O2-的清除率随牛蒡多糖质量浓度的升高而升高，并表现出较好的量效关系，结果与周浓等人[17]的报道相似。通过计算其IC50值表明，＜5 k 组分的为1.45 mg/mL，5～8 k 组分的为1.31 mg/mL，8～30 k 和30～50 k 组分的均为1.40 mg/mL，50～300 k 组分的为1.14 mg/mL，＞300 k 组分的为1.51 mg/mL，提示50～300 k 的牛蒡多糖对·O2-的清除效果最好，而＞300k 的最差。

2.2.2 牛蒡多糖降血糖活性研究

（1）α -淀粉酶的抑制效果。

抑制α -淀粉酶的效果见图4。

图4 抑制α -淀粉酶的效果

对α -淀粉酶的抑制能有效阻碍食品中糖类的水解、消化，从而减少机体对糖分的摄取，从而降低血糖水平[18]。由图4 可知，在0.1～0.5 mg/mL 质量浓度范围内，对α -淀粉酶的抑制率随牛蒡多糖质量浓度的升高而升高，并呈现出良好的量剂关系，说明各组分都具有较好的α -淀粉酶抑制活性。通过计算其IC50值，＜5 k 组分的为0.28 mg/mL，5～8 k和8～30 k 组分的都为0.26 mg/mL，30～50 k 组分的为0.33 mg/mL，50～300 k 组分的为0.30 mg/mL，＞300 k 组分的为0.42 mg/mL，表明5～8 k 和8～30 k的牛蒡多糖抑制α -淀粉酶的效果最好，而＞300 k的最差。

（2）α -葡萄糖苷酶的抑制效果。

抑制α -葡萄糖苷酶的效果见图5。

图5 抑制α -葡萄糖苷酶的效果

抑制α -葡萄糖苷酶的活性可以减缓葡萄糖的生成和吸收，调整血糖水平，减少高血糖对胰腺的刺激，有效预防和改善糖尿病的发生和发展[19]。由图5 可知，不同分子量段的牛蒡多糖在0.1～0.5 mg/mL质量浓度范围内，对α -葡萄糖苷酶的抑制率随牛蒡多糖质量浓度的升高而升高，表现出较好的抑制效果和量效关系。计算其IC50值表明，＜5 k 组分的为0.31 mg/mL，8～30 k 组分的为0.29 mg/mL，5～8 k和50～300 k 组分的都为0.25 mg/mL，30～50 k 组分的为0.32 mg/mL，＞300 k 组分的为0.36 mg/mL，可知5～8 k 和50～300 k 的牛蒡多糖抑制α -葡萄糖苷酶的抑制效果最好，而＞300 k 的最差。

2.2.3 牛蒡多糖降血脂活性研究结果

（1）结合甘氨胆酸钠能力。

结合甘氨胆酸钠的效果见图6。

图6 结合甘氨胆酸钠的效果

由图6 可知，不同分子量段的牛蒡多糖对甘氨胆酸钠的结合率随牛蒡多糖质量浓度的升高而升高，且呈较好的量效关系。从各组分的IC50值来看，＜5 k组分的为4.91 mg/mL，5～8 k 组分的为3.83 mg/mL，而其中组分在质量浓度为5 mg/mL 时，结合率都小于50%，无法计算其IC50值。相对而言，分子量为5～8 k 的牛蒡多糖结合甘氨胆酸钠的能力较好。

（2）结合牛磺胆酸钠能力。

结合牛磺胆酸钠的效果见图7。

图7 结合牛磺胆酸钠的效果

由图7 可知，不同分子量段的牛蒡多糖对牛磺胆酸钠的结合率随牛蒡多糖质量浓度的升高而升高，表明各组分均有一定的牛磺胆酸钠结合能力，并与质量浓度呈正相关。从各组分的IC50值来看，5～8 k 组分的为3.23 mg/mL，＞300 k 组分的为4.53 mg/mL，其中组分在试验最高质量浓度下结合率都小于50%，说明5～8 k 的牛蒡多糖对牛磺胆酸钠的结合效果较好。

3 结论

试验将牛蒡使用热水浸提法制备、醇沉后，采用不同分子量的超滤膜分离，获得分子量＜5，5～8，8～30，30～50，50～300，＞300 k 的6 个牛蒡多糖组分。结果表明，表明牛蒡多糖主要由分子量大于30 k的多糖组成，分子量小于8 k 的占比较少。生物活性分析表明，不同组分牛蒡多糖都表现出一定的生物活性，其中5～8 k 的牛蒡多糖对DPPH·和·O2-的清除能力，抑制α -淀粉酶和α -葡萄糖苷酶，结合甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠能力较好，提示5～8 k 的牛蒡多糖具有最好的抗氧化、降血糖和降血脂活性，进一步开发利用的价值较大。不同分子量牛蒡多糖在生物活性上的差异，可能与其结构、含量、化学组成等有关，可对多糖的结构、组成与多糖生物活性的关系进行进一步探讨。