体外炎性诱导星形胶质细胞激活及功能分析

程莹莹 ， 武建军， 蔡海燕， 焦旭文， 马江波， 丁银秀*

1.宁夏医科大学基础医学院人体解剖学系，宁夏 银川 750006； 2.西安医学院第二附属医院神经外科，陕西 西安 710038； 3.宁夏回族自治区人民医院神经内科，宁夏 银川 751006

神经炎症作为一种基本的细胞内进展，是脑内稳态丧失的一种预警信号[1]。研究报道，机体受损时，反应性星形胶质细胞可能参与并加剧神经炎症过程，通过其形态及功能变化、释放大量炎性物质，如IL-1β、IL-6、NO 等，导致神经变性、死亡[2～4]。研究表明，占大脑内神经胶质细胞85%～95%的星形胶质细胞，在中枢神经系统的发育和功能中起着至关重要的作用，包括支撑营养、维持突触内稳态、调节并保护神经元、参与血脑屏障等[5,6]，揭示星形胶质细胞几乎在所有的中枢神经系统疾病中都发挥着重要的神经保护或神经毒性作用[7,8]，而其在炎症反应中具体的变化及发挥的作用仍不清楚。因此，本实验通过体外给予LPS、IFN-γ炎性刺激，模拟体内病理状态下的大脑微环境，通过观察星形胶质细胞的激活及功能变化，从而为神经炎症发生发展的作用机制提供初步的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

C57BL/6 野生型新生仔鼠（1～3 d），由宁夏医科大学实验动物中心提供，SPF 级，符合伦理学规定，遵循实验动物管理条例。

1.2 主要试剂

DMEM 培养基、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶、HBSS 液 购 自Gibco 公 司；lipopolysaccharide (LPS)、interferon-γ (IFN-γ) 购 自Sigma 公 司；兔 抗iNOS、ARG1、β-actin、TNF-α、IL-10，鼠抗IL-6 均购自CST 公司，兔抗GFAP 购自DAKO 公司，TGF-β1 购自Sigma公司；Alexa Fluo594 荧光标记山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG、Alexa Fluo488 荧光标记山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 抗体均购自Invitrogen 公司。H-1000 封片剂购自Vector 公司。

1.3 方法

1.3.1 星形胶质细胞的原代培养 按照常规细胞培养流程，进行小鼠皮层星形胶质细胞的原代培养。取出生1～3 d 的野生型C57BL/6 仔鼠的大脑皮层，镜下剔除血管及被膜，0.25%胰蛋白酶消化液处理剪碎的组织，终止消化后，吹打，200 目筛网过滤，离心弃上清，制成单细胞悬液。以1×106密度接种在T 75 cm2培养瓶，于37 ℃孵育箱中培养，随后每3 d 换液1 次，待细胞长至90%，进行细胞纯化、传代。传至第3 代，GFAP 免疫染色鉴定纯度达95%以上用于后续实验。

1.3.2 实验分组 参照文献报道的炎性刺激方法[9,10]，取100 ng /ml LPS 和20 ng /ml IFN-γ 剂量，随机分 为Control、LPS（100 ng/ml）、IFN-γ（20 ng/ml）、M1（LPS，100 ng/ml+IFN-γ，20 ng/ml）4 组。给药处理24 h 后进行实验。

1.3.3 免疫细胞化学 细胞炎性处理后，4%多聚甲醛室温固定30 min，封闭液（0.3% Triton X-100+1%BSA）室温孵育1 h，加入一抗（GFAP）溶液4 ℃孵育过夜，加入荧光二抗，室温避光孵育2 h，胞核复染10 min，H-1000 封片剂封片。Olympus 激光共聚焦显微镜观察并采集图像。

1.3.4 CCK-8 细胞活力检测 将第3 代细胞种植于多聚赖氨酸包被的96 孔板内。培养4 d 时，镜下观察细胞生长良好，细胞数量达到70%以上，LPS 和或IFN-γ 作用24 h 后，CCK-8 检测，492 nm 处检测吸光度，分析各组细胞的活力状态。

1.3.5 Western blot 蛋白电泳 各组细胞加入RIPA 裂解液，超声震碎仪冰上裂解30 min 后，4 ℃下13 000 r/min 离心15 min，收集样本。BCA 蛋白定量。经配胶、上样、电泳（80～120 V）、转膜（300 mA, 2 h,冰上）、封闭（室温, 摇床30 r, 2 h）后，加入第一抗体（iNOS、ARG1、IL-10），4 ℃摇床孵育过夜。入HRP标记的二抗，室温/摇床孵育2 h。发光显影，记录图像数据用于定量分析。

1.4 统计学分析

应用GraphPad Prism 5.0 软件，采用One-way ANOVA 分析对数据进行统计学分析，结果以均数±标准误( mean±SEM )表示。当组间比较P值小于0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 星形胶质细胞的原代培养与鉴定

镜下观察发现，原代培养星形胶质细胞10 d 时，细胞贴壁生长，数量较多，呈“铺路石”样排列，胞核较大，呈圆形或卵圆形，胞体呈梭形，折光性偏暗，可发出许多胞突。传代至第3代时，GFAP/Hoechst免疫荧光染色鉴定，星形胶质细胞的纯化率达95%以上（图1）。

图1 星形胶质细胞的原代培养与纯度鉴定A：倒置相差显微镜下观察星形胶质细胞的生长情况（10 d，视野下灰色区域为星形胶质细胞，上层较小的发亮的细胞为小胶质细胞） B：GFAP 阳性细胞率95%以上（红色）Fig.1 Primary cultured astrocytes and its purity identification. A:The growth of astrocytes was observed under inverted phase contrast microscope(10 days, the gray and diffuse areas were astrocytes in the visual field, the smaller, shiny cells in the upper layer were microglia); B: The ratio of GFAP positive astrocytes was over 95% (red).

2.2 炎症环境中，星形胶质细胞形态改变，GFAP 阳性细胞数量增多

给予M1 刺激24 h 后，GFAP 阳性细胞胞体肿胀变大，形态改变并扭曲，突起变长，细胞数量明显增多。统计分析发现，与Control 组相比，M1 组GFAP 阳性细胞明显增多，差异有统计学意义（P＜0.001）（图2）。

图2 LPS 和IFN-γ 联合刺激下星形胶质细胞的形态改变和数量变化A:免疫荧光染色发现，各组GFAP 阳性细胞的形态学改变（红色）B:各组的GFAP 阳性细胞数量***P＜0.001Fig.2 The morphological and quantitative changes of astrocytes after LPS and IFN-γ combined stimulation. A:The morphological changes of GFAP positive astrocytes in each group were detected by immunocytochemical staining (red); B: The cell numbers of GFAP positive astrocytes in each group; ***P＜0.001.

2.3 炎症干预下，星形胶质细胞活力下降

给予LPS 和或IFN-γ 炎性刺激24 h 后，测定细胞活力。结果显示，与Control 组相比，LPS 组、IFN-γ 组及M1 组的吸光度（Absorbance Values）均升高；其中M1 组吸光度显著升高，表明其死亡细胞数目增多，细胞活力下降（P＜0.001）（图3）。

图3 炎症刺激下星形胶质细胞的细胞活力的变化情况各组细胞的吸光度比较,***P＜0.001 ns,无统计学意义Fig. 3 Cell viability of astrocytes under inflammatory stimulation. The absorbance values of each group were compared. ***P＜0.001, ns, no statistical significance.

2.4 炎症干预下，星形胶质细胞上诱导促炎因子表达升高

炎症干预下，测定星形胶质细胞GFAP 及促炎因子（iNOS、IL-6、TNF-α）表达的变化情况。Western blot 结果显示，给予M1 刺激24 h 后，GFAP 及促炎因子iNOS、IL-6、TNF-α 的 蛋 白 表 达 显 著 升 高，与Control 组、LPS 组和IFN-γ 组相比，差异有统计学意义（P＜0.001）（图4）。

图4 Western blot 蛋白分析法测定炎症刺激下促炎因子的蛋白表达水平A: GFAP, iNOS, IL-6, TNF-α和β-actin 的免疫蛋白条带B: 各组的灰度值比较, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001,ns.无统计学意义Fig. 4 The protein expression of pro inflammatory factors under inflammatory stimulation by Western blot. A: The immunoblotting bands of GFAP, iNOS, IL-6, TNF-α and β-actin; B:The gray values of each group were compared; *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, ns,no statistical significance.

2.5 炎症环境中，星形胶质细胞上诱导抗炎因子表达情况

炎症干预下，测定星形胶质细胞抗炎因子（ARG1、IL-10 、TGF-β1）表达的变化情况。Western blot 结果显示，与Control 组相比，给予LPS、IFN-γ 炎性刺激24 h 后，ARG1、IL-10 、TGF-β1 各组的表达水平呈上调趋势；其中，与LPS 组相比，M1 组的ARG1表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）（图5）。

图5 Western blot 法测定炎症刺激下抗炎因子的蛋白表达水平A:ARG1, IL-10,TGF-β1 和βactin 的免疫蛋白条带 B-D:各组的灰度值比较 *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001,ns.无统计学意义Fig.5 The protein expres sion of anti-inflammatory factors under inflammatory stimulation by Western blot. A: The immunoblotting bands of ARG1, IL-10, TGF-β 1 and β-actin; B-D: The gray values of each group were compared; *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001， ns, no significance.

3 讨论

神经炎症作为一种基本的细胞内进程，依赖其与神经元、星形胶质细胞、血脑屏障和中枢神经系统中浸润的T 细胞的细胞间相互作用，是阿尔兹海默症、帕金森病、急性创伤性脑损伤及感染性神经病理学等神经系统疾病的典型特征[11]。

近年来，对星形胶质细胞在神经炎症中扮演的角色仍存在较大的分歧和争议。研究表明，星形胶质细胞被激活后，分泌营养因子等发挥神经保护作用，而过度激活时，会分泌大量炎性因子，导致神经损伤[12,13]。本研究旨在探讨星形胶质细胞参与神经炎症的功能意义，采用细胞培养、免疫细胞化学、免疫印迹等方法，观察炎性刺激下星形胶质细胞的激活及其功能变化。结果表明：炎性刺激后，星形胶质细胞被异常激活，数量增多，形态改变，促炎因子iNOS、IL-6、TNF-α 表达上调，发生A1 样功能极化表现。

结合文献报道及前期研究发现，神经炎症是把“双刃剑”，核心环节是神经胶质细胞的激活，在促炎环境中，小胶质细胞发生M1/M2 极化，分泌部分炎性因子，一方面作用于神经元，引起变性死亡，另一方面激活星形胶质细胞，分泌细胞因子，加重神经炎症与损伤；相反，在抗炎环境中，M2 型小胶质细胞作用星形胶质细胞，使其发生A2 表型，二者协同发挥神经保护或神经修复作用[14-16]。前期研究发现，LPS 作用于小胶质细胞后，小胶质细胞发生M1/M2 极化，而在星形胶质细胞作用不显著；给予M1 刺激后，星形胶质细胞极化效果显著。也就是说，部分的星形胶质细胞被LPS 激活后，同时释放促炎因子和抗炎因子，一方面引发/加速炎症反应，另一方面清除细胞碎屑、营养修复受损细胞。因此，LPS 组的促炎因子和抗炎因子均表达上调。给予M1 刺激后，显著激活星形胶质细胞发生极化，与LPS 组相比，促炎效应明显大于抗炎效应，导致促炎因子表达明显升高，而部分抗炎因子表达呈下调趋势；引起我们思考的是，与CON 组相比，LPS 组和M1 组的抗炎因子均上调，M1 组仅比LPS 组表达略低，可能是因为在LPS 作用下，被激活的部分星形胶质细胞为抗炎型细胞，为了稳定细胞/机体状态，分泌部分抗炎因子（ARG1、IL-10、TGF-β 1），发挥神经保护作用；而在M1 作用下，星形胶质细胞明显激活极化，促炎型细胞数量明显多于抗炎型细胞数量，但抗炎型细胞仍有部分存活，从而炎性因子明显上调，而抗炎因子降低。此外，TGF-β1 作为星形胶质细胞特异性分泌因子，星形胶质细胞受不同程度刺激后均会分泌TGF-β1，TGF-β1 表达上调。该结果提示炎性刺激诱导星形胶质细胞发生A1 样极化及功能变化，有助于深入认识星形胶质细胞在神经炎症中的角色及机制问题。

尽管有学者认为，主导神经炎症发生的是小胶质细胞的“第一触发或反应识别”，但我们认为星形胶质细胞在神经炎症的后续发展中扮演着不容忽视的角色。一是星形胶质细胞在中枢神经系统中分布广泛，二是其在生理稳态和病理进程中的价值，都值得我们强烈关注。此外，在神经炎症的发生发展中，小胶质细胞与星形胶质细胞之间的互作效应也值得深入研究。