基于TLR4/MyD88/MAPK信号通路探讨脉络舒通丸抗血栓性浅静脉炎的作用机制研究*

王清果，曹宁宁，李市荣，张琬靖，孙成宏，姚景春，张贵民，肖学凤

（1.天津中医药大学中药学院，天津 301617；2.天津中医药大学第二附属医院，天津 300250；3.鲁南制药集团股份有限公司新药药理中心，临沂 276000；4.国家癌症中心，国家肿瘤临床医学研究中心，河北中国医学科学院肿瘤医院，廊坊 065001）

血栓性浅静脉炎是常见的静脉血栓性疾病，临床表现为局部发红、灼热、肿胀，出现结节或条索状物，并伴有明显的疼痛感[1]。血管内皮损伤、血流淤滞和高凝状态为造成血栓性浅静脉炎的重要因素，血管内皮损伤导致膜下胶原暴露，血小板附着，同时启动凝血级联反应[2]；血流淤滞和高凝状态下，血小板聚集，纤溶蛋白活性下降，引起局部凝血因子积聚，导致血栓形成[3]。随着研究深入，研究者发现炎症因子可以诱导血管内皮细胞组织因子的表达，抑制抗凝物质，诱导纤溶酶原激活剂抑制物生成，进而促进血栓形成[4]。研究发现，白细胞介素-1β（IL-1β）直接作用于血管内皮细胞，损害内皮功能并促进组织因子表达，造成局部血栓[5]，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可以降低内皮细胞表面血栓调节蛋白的表达，从而抑制蛋白质C 的活化，导致机体抗凝功能受损[6]。目前临床主要以抗凝、溶栓、抗炎、抗感染等手段治疗血栓性浅静脉炎[7]。虽然这些治疗方式对血栓性浅静脉炎具有缓解作用，但常会产生瘀斑、紫癜等多种不良反应，且易复发[8]。中药具有疗效好、毒副作用少等优势，且临床运用中药复方治疗血栓性浅静脉炎独具特色[9]。

脉络舒通丸源于国医大师唐祖宣临床经验方，由黄芪、金银花、黄柏等12 味中药组成，具有清热解毒、化瘀通络、祛湿消肿功效。现代药理学研究显示，黄芪、当归、金银花和玄参等中草药具有抗氧化、抑制炎症介质表达、抗血小板凝集和抗血栓形成的作用[10-14]；水蛭、蜈蚣和全蝎3 种虫类药材能够抑制血小板聚集，增强纤溶活性[14]；以上结果表明脉络舒通丸可以起到防止血栓形成和抑制炎症作用。脉络舒通丸是中国范围内医药市场唯一批准对症治疗血栓性浅静脉炎的中成药，临床应用疗效确切，效果显著[15]。临床研究发现，脉络舒通丸可以明显减轻血栓性浅静脉炎和下肢深静脉血栓患者的临床症状，降低炎症因子水平及血液流变学指标[16-17]。股骨头坏死患者经脉络舒通丸治疗后，静脉血流速度加快，凝血指标得到改善，深静脉血栓发生率显著降低[18]，但脉络舒通丸治疗血栓性浅静脉炎的作用机制尚不明确。

研究发现，炎症反应在血栓性浅静脉炎发生发展中发挥重要作用[4]。Toll 样受体（TLRs）作为体内重要的模式识别受体，可以有效地监测病原微生物的入侵，导致系统炎症反应，受体Toll 样受体4（TLR4）是TLRs 家族中的一员，通过髓样分化因子88（MyD88）通路触发下游丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，激活MAPK 级联反应，最终导致TNF-α、白细胞介素-6（IL-6）及IL-1β 等促炎细胞因子的过度释放[19]。因此，TLR4/MyD88/MAPK信号通路与炎症反应密切相关。川芎和白芍联合使用可以抑制TLR4/MyD88/MAPK信号通路，发挥抗炎和抗细胞凋亡作用，从而治疗中脑动脉栓塞[20]。天降血栓通丸通过抑制TLR4/MyD88 信号通路的激活，降低炎症因子和细胞黏附分子的表达水平，抑制动脉粥样硬化小鼠主动脉斑块形成[21]。以上研究表明，下调TLR4/MyD88/MAPK信号通路可以减轻炎症反应程度，从而发挥血管保护作用。因此，本课题基于TLR4/MyD88/MAPK信号通路，从炎症方面初步探讨脉络舒通丸对血栓性浅静脉炎的治疗作用及潜在机制，旨在为脉络舒通丸的临床应用提供坚实的理论基础，进一步为血栓性疾病的预防和治疗提供新思路和新方法。

1 材料

1.1 动物 36 只日本大耳白兔，雌雄各半，体质量2.50～2.75 kg，购于中国食品药品检定研究院，许可证号：SCXK（京）2019-0006，饲养于天津中医药大学实验动物中心。本实验所有操作均符合相关动物实验伦理原则，并获得天津中医药大学实验动物伦理委员会批准（动物伦理委员会编号：TCMLAEC2021253）。

1.2 药物与试剂 脉络舒通丸（鲁南厚普制药有限公司，国药准字Z20090636，批号：918200011），地奥司明片（南京正大天晴制药有限公司，国药准字H20058471，批号：A211010），20%甘露醇（山东华鲁制药有限公司，国药准字H37020843，批号：201003A01），0.9%氯化钠注射液（石家庄四药有限公司，国药准字H13023202，批号：2112221909）。兔血清及组织TNF-α、IL-1β、IL-6 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（武汉基因美科技有限公司，批号分别为：JYM0003Rb、JYM0011Rb、JYM0006Rb）；电致化学发光（ECL）试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，批号：S7105010）；RIPA 组织/细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司，批号：R0010）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，批号：20201ES76）；TLR4、MyD88、c-氨基酸末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（P-JNK）、p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（Pp38MAPK）、细胞外信号调节激酶（ERK1/2）、磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）兔单克隆抗体（美国CST 公司，批号分别为：38519、4283、9252、4668、8690、4092、9102、4376）；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）鼠单克隆抗体（美国CST 公司，批号：97166）；山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）重链和轻链（H+L）辣根过氧化物酶（HRP）二抗、山羊抗鼠IgG（H+L）HRP二抗（美国Affinity Biosciences 公司，批号分别为：S0001、S0002）。

1.3 仪器 3K15 型冷冻高速离心机（美国Sigma 公司）；Infinite M200 Pro 型多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）；全自动血凝分析仪（CA-1500，日本sysmex 株式会社）；ASP200S 自动真空组织脱水机（德国Leica公司）；EG1150H 自动生物组织包埋机（德国Leica 公司）；RM2255 切片机（德国Leica 公司）；Nikon Ci-L显微镜（日本Nikon 公司）；电泳转膜设备（DYY-7C、DYCZ-40D，北京六一生物科技有限公司）；化学发光成像系统（Chemi Scope6200 上海勤翔科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 将36 只日本大耳白兔随机分为正常组、模型组、地奥司明（阳性药，0.168 g/kg）组、脉络舒通丸低剂量（0.56 g/kg）组、脉络舒通丸中剂量（1.68 g/kg）组、脉络舒通丸高剂量（5.04 g/kg）组，每组6 只。除正常组注射等量生理盐水外，其余各组采用双侧耳缘静脉注射20%甘露醇建立血栓性浅静脉炎兔模型。操作方法：在兔耳缘静脉距耳尖2 cm 处用0.9%氯化钠注射液进行预穿刺，确保头皮针在静脉血管中且药液无外渗后，以1 mL/min速度缓慢推注20%甘露醇溶液（4 mL/kg），每日2 次，连续注射14 d，所有兔两耳均同时注射。造模期间每日观察耳缘静脉及其周围组织皮肤颜色，若皮肤变红并有硬结，表示造模成功[22]。

造模同时，模型组与正常组均灌胃纯水，各给药组灌胃相应剂量药物，连续灌胃给药14 d。根据人与动物等效剂量换算法，阳性药地奥司明给药剂量0.168 g/kg 相当于临床等效剂量的1 倍；脉络舒通丸低、中、高给药剂量（0.56、1.68、5.04 g/kg）相当于临床等效剂量的1/3、1、3 倍。实验结束后采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，心脏取血[23]。以静脉穿刺点前方1.5 cm 为中心，切取1 cm2耳廓组织，一部分耳廓组织固定于4%多聚甲醛溶液，另一部分耳廓组织-80 ℃储存备用。

2.2 兔耳组织病理学检测 取上述兔耳组织样本固定后经石蜡包埋，制成切片，二甲苯脱蜡后水化，苏木素染色5 min，用1%盐酸乙醇分化10 s，伊红染色1 min，中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照，进行组织病理学评分，评分标准如下。0 分：无静脉内皮细胞损伤，无炎性细胞浸润，无血栓形成；1 分：轻微静脉内皮细胞损伤，轻微炎性细胞浸润，血栓面积小于1/3 管腔；2 分：中度静脉内皮细胞损伤，中度炎性细胞浸润，血栓面积1/3～2/3 管腔；3 分：重度静脉内皮细胞损伤，重度炎性细胞浸润，血栓面积大于2/3 管腔。每个兔耳样本的组织学评分为3 个不同视野下的3 个病理指标总分的平均值。

2.3 兔血清中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的含量 取各组兔血清适量，严格按照ELISA 试剂盒说明书要求检测IL-1β、TNF-α 和IL-6 的含量。

2.4 凝血功能测定 各组血浆置于全自动血凝分析仪，检测其活化部分凝血酶原激活物活化时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（FIB）浓度。

2.5 兔耳组织中TLR4/MyD88/MAPK信号通路 相关蛋白表达水平的测定兔耳组织样本加入裂解液进行裂解，4 ℃条件下离心20 min（12 000 r/min，离心半径5.5 cm），酶标检测仪测定562 nm 波长下的各孔吸光度值，绘制标准曲线，计算各样品浓度。将5×蛋白上样缓冲液与样品以1∶4 的比例进行充分涡旋，密封，煮沸8 min；等量蛋白采用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，湿转法转膜（120 V，1 h），转印完成的PVDF 膜用5%的脱脂奶粉浸泡，室温封闭1 h，加入现配且比例稀释好的TLR4、MyD88、P-p38MAPK、p38MAPK、P-ERK1/2、ERK1/2、P-JNK、JNK 及GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜；次日室温孵育山羊抗兔或山羊抗鼠IgG（H+L）HRP 二抗1 h，ECL 发光液进行显色，凝胶成像系统成像并运用Image J 图像处理软件进行灰度值分析。

2.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 7.0 软件对各组数据进行统计学分析，数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两组数据之间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 脉络舒通丸对兔耳组织病理学的影响 观察兔耳组织切片，苏木精-伊红（HE）染色结果显示，正常组兔耳组织静脉内膜光滑，内皮细胞呈梭形排列，均匀有序，无血栓形成和炎性细胞浸润。与正常组比较，模型组兔耳组织静脉内膜严重脱落，血管管腔不规则，有明显血栓生成，管腔和周围组织有大量炎性细胞浸润。与模型组比较，脉络舒通丸低、中、高剂量组、地奥司明组兔耳组织静脉内膜脱落和内皮细胞损伤均有不同程度改善，伴有轻度血栓形成，血管壁和周围组织炎性细胞浸润显著减少。值得关注的是，脉络舒通丸高剂量组病理损伤改善最为明显，见图1A。病理组织学评分结果显示，与正常组比较，模型组病理学评分明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，脉络舒通丸低、中、高剂量组、地奥司明组病理学评分均有不同程度降低，差异具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），且脉络舒通丸高剂量组评分低于地奥司明组，表明脉络舒通丸可以明显改善血栓性浅静脉炎模型兔病理变化，见图1B。

图1 各组兔耳组织病理学变化情况

3.2 脉络舒通丸对血栓性浅静脉炎模型兔血清中IL-1β、TNF-α 和IL-6 水平的影响 结果显示，与正常组比较，模型组兔血清中IL-1β、TNF-α 和IL-6的表达水平升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明模型组兔具有明显的炎症反应。与模型组比较，脉络舒通丸低、中、高剂量组及地奥司明组血清中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表达水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），结果表明脉络舒通丸能够显著抑制血栓性浅静脉炎模型兔的炎症反应。见表1。

表1 兔血清中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表达情况（±s）pg/mL

表1 兔血清中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表达情况（±s）pg/mL

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别动物数IL-1βTNF-αIL-6正常组631.76±1.97 14.62±1.77 13.32±2.09模型组659.21±2.37* 27.40±2.76* 31.56±2.27*脉络舒通丸低剂量组651.33±2.86## 23.43±1.68# 24.35±1.77##脉络舒通丸中剂量组640.53±2.19## 20.35±1.36## 19.76±3.42##脉络舒通丸高剂量组637.45±2.62## 18.90±1.16## 20.62±2.95##地奥司明组641.73±3.06## 17.34±2.01## 19.64±2.54##

3.3 脉络舒通丸对血栓性浅静脉炎模型兔凝血功能的影响 与正常组比较，模型组兔血浆APTT、PT和TT 缩短，FIB 含量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，脉络舒通丸低、中、高剂量组及地奥司明组兔APTT、PT 和TT 延长，FIB 含量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），提示脉络舒通丸可以改善血栓性浅静脉炎模型兔的凝血功能。见表2。

表2 兔血浆中APTT、PT、TT 和FIB 结果（±s）

表2 兔血浆中APTT、PT、TT 和FIB 结果（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别动物数 APTT（s）PT（s）TT（s）FIB（g/L）正常组6 20.20±0.70 8.63±0.22 7.49±0.44 3.67±0.14模型组6 15.95±0.73* 6.99±0.28* 5.72±0.46* 5.77±0.20*脉络舒通丸低剂量组6 17.63±0.76## 7.33±0.27# 6.22±0.27# 5.32±0.31#脉络舒通丸中剂量组6 18.83±0.60## 7.53±0.17## 7.09±0.34## 5.04±0.21##脉络舒通丸高剂量组6 19.81±0.94## 7.81±0.19## 7.02±0.21## 4.68±0.22##地奥司明组6 19.48±1.93## 7.60±0.16## 7.18±0.22## 4.84±0.22##

3.4 脉络舒通丸对血栓性浅静脉炎模型兔TLR4/MyD88/MAPK信号通路相关蛋白表达的影响 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测结果显示，与正常组比较，模型组兔耳组织中TLR4、MyD88、MAPK（p38MAPK、ERK1/2 和JNK）蛋白及其相关磷酸化水平均上调，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，脉络舒通丸低、中、高剂量组及地奥司明组上述蛋白表达均下调，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见图2。

图2 兔耳组织中TLR4/MyD88/MAPK信号通路相关蛋白的表达情况（±s，n=6）

4 讨论

中医理论认为，血栓性浅静脉炎属于“赤脉”“青蛇毒”“恶脉”等范畴，多由湿热之邪外侵，蕴结不散，郁而化热，导致血行不畅，瘀血滞于脉络阻塞所致。因此，中医多以清热利湿、活血化瘀为主治疗血栓性浅静脉炎[24-25]。脉络舒通丸是国医大师唐祖宣的经验方，其通过融合当归补血汤、芍药甘草汤、四妙勇安汤、止痉散等经典名方化裁而来。全方由黄芪、金银花、黄柏、苍术、薏苡仁、玄参、当归、白芍、甘草、水蛭、蜈蚣、全蝎12 味中药组成，其中黄芪、金银花为君药，益气利水、清热解毒；黄柏、苍术、薏苡仁、玄参、当归、白芍为臣药，清热祛湿、消肿解毒；水蛭、蜈蚣、全蝎为佐药，活血消瘀、通络止痛；甘草为使药，调和诸药，全方共奏清热解毒、化瘀通络、祛湿消肿之效。脉络舒通丸用于治疗湿热瘀阻脉络所致的血栓性浅静脉炎及非急性期深静脉血栓形成所致的下肢肢体肿胀、疼痛、肤色暗红或伴有条索状物，临床应用广泛，疗效显著。

现代药理学研究表明，脉络舒通丸中当归及其成分不仅可以通过调节机体免疫反应减轻炎症介质的表达，也可以抗血小板聚集，防止血栓形成[26]。黄芪一方面能够抑制IL-6、TNF-α 表达，另一方面可以通过降低血浆FIB 含量，改善红细胞功能，发挥抗血栓作用[27]。金银花和玄参具有抑制多种促炎症因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）表达及上调抗炎因子IL-10 表达的良好抗炎作用[28]。此外，金银花含有的有机酸类化合物亦具有抗血小板凝集的功效[29]。甘草、黄柏、苍术、白芍等均可以起到较好的抗炎和抗菌药效[30]。水蛭、全蝎和蜈蚣皆为虫药，具有显著的溶栓和抗血小板聚集功效[31]，故诸药协同可以起到防止血栓形成和抑制炎症作用。施怡芳等[32]研究表明，地奥司明临床治疗下肢血栓性浅静脉炎疗效显著，可以降低血管的扩张性和脆性，改善静脉淤血状态，同时通过控制白细胞及血管内皮细胞崩解、黏附、移形，抑制炎性介质释放。因此，本研究选择地奥司明为阳性药，探讨脉络舒通丸抗血栓性浅静脉炎的作用机制。

研究发现，静脉输液、反复穿刺等因素可以导致血管内皮细胞受损。血管内皮细胞受损后，一方面可以释放多种炎症因子，引起炎症反应，出现热痛、红肿等典型炎症表现。同时，也可以促进凝血因子的过度表达或下调抗凝物质，导致血栓形成，如IL-1β 和IL-6 等可以诱导血管内皮细胞组织因子的表达，促进凝血；TNF-α 可以降低内皮细胞蛋白C受体表达，抑制蛋白质C 的抗凝作用，加重血栓形成[33-34]。另一方面，血管内皮细胞受损后可以激活凝血因子形成凝血酶原激活物，启动内源性凝血系统。同时，受损组织释放的组织因子可以激发外源性凝血系统，使凝血酶原变成有活性的凝血酶，凝血酶激活FIB 形成纤维蛋白，从而导致血栓。因此，临床常用PT、APTT、TT 及FIB 作为指标进行血栓性疾病的检查[35-36]。此外，血栓形成后，血流缓慢使细胞坏死、缺氧，造成白细胞黏附，释放多种炎症细胞因子，进一步加重炎症反应[37]。因此，炎症与血栓之间可以互为因果，相互影响。在血栓性浅静脉炎的发病过程中，多种炎症因子的释放可以促进凝血因子的过度表达，继而导致血栓形成，而凝血系统启动后，又会增加促炎因子的释放，进一步加重炎症反应[38]。

血栓性浅静脉炎的发病病因与炎症密切相关[39]。TLRs 是机体内重要的介导天然免疫的宿主防御机制，在免疫应答及炎症反应中发挥着关键作用。TLR4作为TLRs 家族的重要成员，在炎症反应中扮演重要角色，可参与多种血管性疾病的发生和发展[40]。当刺激物作用于TLR4 后，会激活其下游靶蛋白MyD88，活化的MyD88 能够使白细胞介素-1 受体相关激酶1/4（IRAK1/4）与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）形成复合物，激活转化生长因子β 激活激酶1（TAK1），进而磷酸化MAPK 家族下游激酶ERK1/2、JNK 和p38MAPK，磷酸化的ERK1/2、JNK 和p38MAPK 可以调控炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α转录、合成、释放[41]，从而使机体出现炎症反应。如桂枝-麻黄通过抑制脑缺血损伤模型大鼠TLR4/MyD88/MAPK信号通路的激活，有效降低TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎症因子的表达，从而起到抗炎作用[42]。研究表明，TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎症因子不仅在动脉粥样硬化进展中大量释放并诱导炎症持续发生，而且可以促使胶原蛋白暴露，引起动脉内膜结构发生显著改变，加速易损斑块的形成[43]。另有研究发现抗-β 糖蛋白Ⅰ抗体可以通过激活TLR4/MyD88/MAPK信号通路诱导中性粒细胞胞外陷阱产生，进而促进血栓形成[44]。以上研究结果揭示TLR4/MyD88/MAPK信号通路的异常传导可与多种疾病存在联系，如脑卒中[45]、动脉粥样硬化[46]。因此，本研究主要探讨脉络舒通丸是否通过调控TLR4/MyD88/MAPK信号通路，抑制炎症因子释放，改善凝血功能，进而发挥抗血栓性浅静脉炎的作用。

本研究应用20%甘露醇注射于兔耳缘静脉诱导血栓性浅静脉炎模型，以病理学变化、炎症因子、凝血功能为药效指标，研究脉络舒通丸干预血栓性浅静脉炎的药效。结果表明，脉络舒通丸和地奥司明能够减轻血栓性浅静脉炎模型兔中耳组织的病理损伤，抑制TNF-α、IL-1β 和IL-6 炎性因子的表达，延长APTT、PT 和TT 时间，降低FIB 含量。值得注意的是，脉络舒通丸抑制炎性因子释放的作用强于地奥司明，而地奥司明抑制血栓形成的效果较脉络舒通丸更为显著，表明脉络舒通丸减轻炎症反应的药效更强，而地奥司明改善静脉扩张与静脉血淤滞方面的药效更优。为进一步明确脉络舒通丸干预血栓性浅静脉炎的作用机制，应用Western Blot 技术基于TLR4/MyD88/MAPK信号通路检测了相关蛋白的表达，结果显示，脉络舒通丸和地奥司明干预后，TLR4、MyD88 蛋白水平显著下调，p38MAPK、ERK1/2 和JNK蛋白的磷酸化水平均被显著下调，其中脉络舒通丸对相关蛋白及其磷酸化水平的下调作用更加明显，表明脉络舒通丸可能通过抑制TLR4/MyD88/MAPK信号通路减少炎症因子的释放，减轻炎症反应，改善凝血功能，从而发挥抗血栓性浅静脉炎的作用，为临床应用脉络舒通丸治疗血栓性浅静脉炎提供坚实的理论基础，进一步为血栓性疾病的预防及治疗提供新思路与新方法。