血清miR-497-5p、FGF-2在阿尔茨海默病患者中的表达及相关性分析

李晓艳 徐宇浩 朱 颖 童 娟 李元媛 于 明

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是与年龄相关的神经退行性疾病,以逐渐记忆力恶化和认知功能下降为临床特征[1]。随着人口老龄化进展,AD的发生率及病死率呈上升趋势[2]。探索AD的诊断指标对该疾病的诊疗尤为重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种基因调控因子,可通过多种途径调节AD的发生、发展。研究发现,miR-497-5p在Aβ1-42诱导后的微血管内皮细胞高度表达,通过促进TJs相关蛋白表达而降低了血-脑脊液屏障通透性,可能参与了脑血管屏障对β淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)的清除作用[3]。另外,成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)具有血管生成、有丝分裂和神经营养作用[4]。研究发现,经FGF-2预处理的星形胶质细胞可激活神经配素-1依赖性谷氨酸能突触的发生,从而抑制空间记忆力丧失[5]。然而,有关miR-497-5p、FGF-2和AD的研究多数局限于细胞及动物层面。本研究从临床角度出发,观察了miR-497-5p、FGF-2水平在不同程度AD患者血清中的变化及其对AD的诊断效能,以及两者可能存在的相关性,现报道如下。

资料与方法

1.临床资料:选取2020年10月～2022年6月就诊于江苏大学附属医院神经内科的50例AD患者为AD组,纳入标准:①依据2011年美国国立衰老研究所(National Institute on Aging,NIA)和AD学会(Alzheimer′s Association,AA)制定的诊断标准(NIA-AA诊断标准)[6];②简易精神状态量表(mini-mental state examination,MMSE)评定痴呆的标准:文盲组≤17分,小学组≤20分,中学组≤22分,大学组≤24分;③头颅磁共振提示双侧颞叶、海马萎缩。排除标准:①既往有脑血管疾病者;②有颅脑外伤者;③有中毒性、代谢性、精神性等脑病者;④诊断前进行药物治疗者;⑤合并心脏、肝脏、肾脏、造血系统疾病者;⑥血管性及其他原因所致痴呆者;⑦有其他不宜入选者。另外,根据MMSE评分将AD患者分为:轻度AD组18例(21分≤MMSE评分≤26分)、中度AD组18例(10分≤MMSE评分≤20分)和重度AD组14例(MMSE评分≤9分)。同期选取在江苏大学附属医院行常规检查的37例健康体检者为对照组,其日常生活能力正常,神经系统检查无异常,MMSE评分在28分以上,直系亲属无痴呆家族史且均无重大躯体疾病。所有量表评估由神经内科主治及以上职称医师完成。记录所有研究对象的年龄、性别、受教育程度、高血压、糖尿病、高脂血症、MMSE评分。入组的每位受试者及家属对本研究均知情,并签署知情同意书。本研究获得江苏大学附属医院医学伦理学委员会审查批准(伦理学审批号:SWYXLL20210401-11)。

2.主要仪器与试剂:总RNA提取试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司; miRNA第1链cDNA合成购自山东思科捷生物技术有限公司;miRNA实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试剂盒购自山东思科捷生物技术有限公司;人FGF-2酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司;高速低温离心机购自美国Thermo Fisher公司;紫外分光光度仪购自美国Beckman公司;RT-qPCR仪购自美国Applied Biosystems公司;本研究中其他化学用品均采购自江苏太仓沪试试剂有限公司。

3.方法

(1)标本采集:采集受试者清晨空腹外周血3～5ml,将样本静止于4℃冰箱约1h,接着以3500r/min转速,离心半径10cm,离心10min分离出上层液体血清,分装于无菌无酶EP管中,置于-80℃超低温冰箱保存,待检测。

(2)总RNA的提取和miR-497-5p定量检测:取适量冻融后的血清样本,采用Takara RNAiso Blood提取血清中RNA,用紫外分光光度仪检测RNA的浓度和纯度,依据试剂盒说明书将提取出的RNA反转录为cDNA,依据2×miRNA SYBR Green qPCR Mix(By stem-loop)说明书进行RT-qPCR检测,设置反应体系为10μl,反应条件为94℃ 3min,94℃ 20s,51.7℃ 30s,72℃ 30s,共循环40次,以U6作为内参基因,采用法计算目的基因相对表达量。

(3)引物设计及合成:引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司,采用茎环法合成引物。引物序列如下:miR-497-5p:上游引物:5′ -AACGATACAGCA-GCACACTGT-3′,下游引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC-3′;U6:上游引物:5′-GCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3′,下游引物:5′-CG-AATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′。

(4)血清FGF-2水平检测:按照人FGF-2 ELISA试剂盒的使用说明书操作。

结 果

1.对照组与不同程度AD组一般资料比较:对照组、轻度、中度和重度AD组的年龄、性别、受教育水平、高血压、糖尿病和高脂血症比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同程度AD组MMSE评分均显著低于对照组(P<0.001),AD各组间比较差异有统计学意义(P<0.001),详见表1。

表1 对照组与不同程度AD组的一般资料比较

2.各组血清miR-497-5p、FGF-2水平比较:与对照组和轻度AD组比较,中度、重度AD组血清miR-497-5p水平均升高(P<0.01),中度、重度AD组FGF-2水平均降低(P<0.01);对照组与轻度AD组血清miR-497-5p和FGF-2水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);中度和重度AD组血清miR-497-5p和FGF-2水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),详见表2。

表2 各组血清miR-497-5p和FGF-2水平比较

3.血清miR-497-5p表达水平与MMSE评分相关性分析:Pearson相关性分析结果显示,血清miR-497-5p相对表达量与MMSE评分呈负相关(r=-0.724,P<0.01),由以下散点图可见,在AD患者中MMSE评分越低,miR-497-5p表达越高,详见图1。

图1 血清miR-497-5p相对表达量与MMSE评分的相关性分析

4.miR-497-5p与FGF-2相关性分析:经miRTarBase数据库检索,miR-497-5p与FGF-2可能存在靶向关系,详见表3。Pearson相关性分析结果显示,AD组血清miR-497-5p相对表达量与FGF-2水平呈负相关(r=-0.748,P<0.01),详见图2。

图2 血清miR-497-5p与FGF-2相关性分析

表3 miRTarBase预测miR-497与FGF-2的靶向相互作用

5.各组之间血清miR-497-5p、FGF-2及两者联合对AD诊断价值和不同程度AD鉴别效能评估:miR-497-5p、FGF-2对中度AD和重度AD具有诊断价值,曲线下面积(area under the curve, AUC)分别为0.794、0.849、0.782、0.830;对轻度AD和中度AD、轻度AD和重度AD的鉴别具有效能,AUC分别为0.847、0.881、0.777、0.845;miR-497-5p和FGF-2联合指标对中度AD和重度AD具有诊断价值,AUC分别为0.861、0.922,对轻度AD和中度AD、轻度AD和重度AD的鉴别具有效能,AUC分别为0.879、0.944,详见表4。

表4 各组之间血清miR-497-5p、FGF-2及两者联合对AD诊断价值和不同程度AD鉴别效能评估

讨 论

AD的发病机制仍未阐明,寻找AD相关标志物,且尽早预测其发展尤为重要。miR-497-5p可通过调控细胞增殖和凋亡介导神经发育和重塑等过程,在多种神经系统疾病中被大量研究[7, 8]。Li等[9]研究发现,miR-497-5p在抑郁症小鼠中表达上调,可能与负性调控脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)有关,产生影响记忆相关信号系统的作用。此外,Chen等[10]研究发现,LINC00641

上调可通过抑制miR-497-5p激活TrkB/PI3K/Akt通路,间接促进BDNF蛋白表达。Zhu等[11]研究显示,miR-497-5p在1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridiniumion,MMP)诱导的SH-SY5Y细胞及小鼠中高表达,通过靶向FGF-2调节细胞的凋亡和自噬。本研究中笔者首次以AD患者为研究对象,从临床水平关注了AD患者血清miR-497-5p的表达情况,发现了中重度AD患者血清miR-497-5p表达水平明显升高,提示血清miR-497-5p增加参与AD的发展。

FGF-2是成纤维细胞因子家族成员之一,在多种生物活性的调节中发挥作用[12]。在AD小鼠海马中,FGF-2水平的增加有利于细胞分裂和巢蛋白水平,可降低成熟海马细胞的神经元谱系标志物的水平[13]。FGF-2还存在抗炎和抗淀粉样变性作用,可能与FGF-2促进小胶质细胞对Aβ吞噬作用有关[14]。本研究同样关注了AD患者血清FGF-2表达情况,结果显示,中重度AD患者血清FGF-2呈低表达。大量研究发现,FGF-2可促进海马神经生成,并且在不利的条件下有着神经保护作用[15～18]。本研究也与这些研究结论具有一致性,提示FGF-2降低与AD的发生、发展密切相关。

为了进一步评估miR-497-5p与AD认知功能的相关性,本研究对miR-497-5p与MMSE评分进行相关分析,两者较高的相关系数也表明miR-497-5p对AD患者病情严重程度评估有一定的提示作用。另外,本研究发现,对照组与中度、重度AD组血清miR-497-5p、FGF-2水平比较,差异有统计学意义,而与轻度AD组比较,差异无统计学意义,提示miR-497-5p和FGF-2可能在中重度AD中更具有重要的潜在调控和干预价值。本研究还发现,与轻度AD患者比较,中度、重度AD组血清miR-497-5p、FGF-2水平差异有统计学意义,而在中度和重度AD患者中,血清miR-497-5p和FGF-2水平比较,差异无统计学意义,这可能与AD的病程存在一定的关联。

多项研究证实了miR-497-5p与FGF2之间存在对应关系。在非小细胞肺癌中,miR-497-5p表达下调,并通过影响FGF-2表达调节细胞的增殖和侵袭[19]。在抑郁症小鼠中,miR-497通过靶向FGF-2加重小鼠中的海马胶质细胞活化,从而促进炎症相关因子的产生[20]。不仅如此,本研究通过miRTarBase数据库预测也显示miR-497-5p与FGF-2存在结合位点。本研究相关性分析结果显示,血清FGF-2与miR-497-5p呈负相关,提示两者可能存在某种关系共同参与了AD的发生和发展,其作用机制也需后期进行基础实验进一步验证。此外,ROC曲线分析结果显示,血清miR-497-5p和血清FGF-2水平对中重度AD疾病均有一定的诊断价值,两者联合诊断效能更高;进一步分析显示,联合指标诊断中度、重度AD的效能更高,而诊断轻度AD效能无显著差异,表明在一定程度上可判断疾病的进展程度。联合指标鉴别轻度与中度、重度AD的效能较高,而鉴别中、重度AD的效能差异不明显,也为评估AD发展提供了一定的参考。

综上所述,miR-497-5p和FGF-2在中重度AD患者中存在差异表达,两者对中重度AD具有一定的诊断价值。本研究仍有一些不足,比如研究样本量较小,并未对AD患者的血清miR-497-5p和FGF-2进行随访观察。两者之间可能存在的作用机制以及在AD不同病情程度中的特征性变化,仍需在细胞及动物模型实验中进一步探讨。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。