长链非编码RNA在AKI向CKD转变中的作用研究进展

李玉清 胡琼丹 王 丽

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是以肾功能在短时间内迅速下降为特征的肾脏疾病。全世界每年AKI新发病例约1330万,在我国重症监护室中,危重患者 AKI 发生率达到了30%～50%[1]。有临床数据提示,即使是较快恢复的轻度AKI仍有较高的可能性转变成慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)[2]。AKI向CKD转变通常认为是由AKI的不完全修复而引起的长期功能缺陷[3]。AKI向CKD转变的病理机制涉及多种细胞类型、不同细胞活动以及复杂的分子网络调控,主要包括肾小管上皮损伤、免疫细胞浸润、成纤维细胞活化和间质纤维化等。

长链非编码RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是在表观遗传水平上起着重要调控作用的基因组转录产物,其发挥作用的方式多样,如可以直接与基因组序列相互作用调节基因转录,充当竞争性内源RNA影响mRNA稳定性,还可以与蛋白质相互作用进而调节蛋白功能。此外,lncRNAs在不同细胞、组织、疾病,甚至同一疾病的不同阶段,都表现出表达模式的特异性,可作为疾病发生、发展的潜在生物学标志物。鉴于此,本文围绕lncRNAs在AKI向CKD转变的病理机制的相关研究进行总结,并展望了lncRNAs在AKI向CKD转变方面的临床应用前景。

一、lncRNAs的细胞定位与作用方式

lncRNAs是一类长度大于200nt的非编码RNA,能够参与生命体的众多生理及病理过程。在真核生物中,lncRNAs多由RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)转录生成,经过加帽、剪接、多聚腺苷酸化,最终折叠形成二级、三级结构[4]。lncRNAs是基因调控网络中至关重要的调节因子,在不同生命过程中发挥作用的方式与其特定的亚细胞定位有关。多数的lncRNAs富集于细胞核中,通过与核内的DNA、RNA和蛋白质相互作用,顺式(cis)或反式(trans)调节基因的转录,或调控染色质的结构和功能,或参与无膜细胞核亚结构——核旁斑(paraspeckle)的组装[6]。

转运至细胞质中的lncRNAs可以调节mRNA的稳定性从而调控蛋白翻译,也可以直接调控蛋白质翻译后修饰,lncRNAs还可以竞争结合miRNAs从而负向调控相应miRNAs的功能[7]。此外,还有少部分lncRNAs分布于线粒体、内质网等细胞器隔室中参与细胞器本身的功能与代谢,或定位于细胞间连接处,参与调节信号转导和维持细胞连接的稳定,或被包装入外泌体进行细胞间转移,进而发挥细胞间的调控作用[8]。最后,值得注意的是,部分注释的lncRNAs被发现可以翻译、编码功能性短肽[9]。因此,当研究细胞质lncRNAs的功能时需先评估其编码潜力,确保实验结果反映的是RNA的功能。

表1 AKI向CKD转变过程中已知功能lncRNAs

二、lncRNAs与肾小管上皮细胞损伤

肾近端小管上皮细胞损伤是AKI向CKD进展的驱动因素。当肾脏处于缺血、缺氧、药物、毒素等导致的病理状态时,肾小管上皮细胞(tubular epithelial cell,TECs)极易受到损伤。损伤后的TECs可通过去分化、增殖和再分化促进肾单位的修复,当修复机制受限或受损,则会促进AKI向CKD进展[31]。TECs发生不完全修复时,细胞内出现多途径的细胞程序性死亡相关信号通路的激活、G2/M期细胞周期阻滞、持续性氧化应激等病理变化,lncRNAs在此过程中起着重要的作用。Liu等[10]在人近端肾小管上皮细胞系(HK-2细胞)构建的缺氧诱导的急性肾损伤体外模型中证实,lncRNA MEG3作为细胞质lncRNA可与miR-145-5p竞争性结合以上调rhotekin蛋白(RTKN)的表达,激活Wnt/β-catenin通路,从而诱发线粒体自噬和细胞凋亡。

在人原代TECs构建的AKI模型中,MEG3被发现可竞争性结合miR-18a-3p,促进Gasdermin D表达,激活细胞焦亡信号途径,诱发TECs焦亡[11]。在缺血缺氧诱导的AKI小鼠体内外模型中,lncRNA ENSMUST_147219能够竞争性结合miR-221-5p,促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3 (caspase-3) 增加,从而促进肾近端小管上皮细胞凋亡[12]。此外,也有研究发现在小鼠肾近端小管中敲除mmu-lncRNA 121686能够显著减弱缺血缺氧诱导的细胞凋亡。hsa-lncRNA 520657与mmu-lncRNA 121686序列具有同源性,功能相似,均能作为miR-328-5p的分子海绵,参与缺血、脓毒症以及万古霉素诱导的AKI进展[13]。

近端肾小管损伤后,G2/M期停滞的TECs可以通过分泌更多的促纤维化细胞生长因子(如TGF-β、CCN2等)参与AKI后的促纤维化进程[32]。lncRNAs与细胞周期G2/M期停滞相关研究很少,这提示lncRNAs调控TECs损伤后的G2/M期细胞周期停滞能够成为未来研究AKI向CKD进展的分子机制的切入点。Jiang等[14]研究发现,在人原代脐静脉内皮细胞中敲低lncRNA WEE2-AS1,增加了细胞分裂周期因子25(CDC25B)的表达,提出核定位的WEE2-AS1可能通过正向调节正义链上WEE2编码基因的表达,抑制成熟促进因子活性,阻止细胞由G2期向M期转换,但lncRNAs如何在肾脏G2/M期细胞周期停滞中发挥作用尚缺乏相关实验证据。

TECs内持续性氧化应激、Nrf2抗氧化防御机制受损可促进AKI向CKD转变。lncRNAs参与了TECs中的氧化应激,在氧化或抗氧化系统中发挥着积极或消极作用。例如,研究发现lncRNA ENST00000453774.1(lncRNA 74.1)可以通过增强Nrf2-keap1信号转导来抑制TGF-β诱导的HK-2细胞中的氧化应激,从而减缓纤维化进程。Shi等[16]研究发现,lncRNA SNHG14可以通过与miR-93竞争性结合,从而负向调控miR-93靶向IL-1受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase4,IRAK4)和IL-6R阻断NF-κB、STAT3信号转导的功能,最终加剧LPS诱导的HK-2细胞的氧化应激,加速细胞死亡。

三、lncRNAs与免疫细胞浸润

持续存在的炎性反应是促进AKI向CKD转变的关键因素。损伤后的TECs释放损伤相关模式分子(danger associated molecular pattern,DAMPs),招募先天免疫细胞如单核细胞、中性粒细胞等聚集至受损部位参与一系列的促炎或抗炎反应[33]。lncRNAs可通过参与趋化因子的产生、炎症相关基因的表达或免疫细胞的激活、分化等多种调控机制参与肾脏中的炎性反应。如lncRNA IRAR能够通过调节TECs中CCL2、CXCL1、CXCL2等趋化因子的表达促进缺血性AKI的病程进展[18]。LRNA9884则可以通过上调MIF的产生,加剧肾脏炎性反应[19]。巨噬细胞由于本身功能的复杂性,是肾脏持续性炎性反应的主要参与者。例如,Hu等[17]研究发现,lincRNA-Cox2的表达水平在 LPS刺激后的RAW264.7 细胞(小鼠巨噬细胞细胞系)中快速上升,lincRNA-Cox2能够将NF-κB 亚基整合到SWI/SNF复合物中,最终调节SWI/SNF相关的染色质重塑和巨噬细胞中晚期炎症相关基因的转录。Atianand等[20]研究发现,lincRNA-EPS是重要的炎症抑制因子,它可以通过与核内不均一核糖核蛋白L(hnRNPL) 相互作用抑制巨噬细胞内炎症相关基因的表达,lincRNA-EPS敲除小鼠在脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS) 刺激后会表现出更强的炎性反应和更高的致死率。

lncRNAs也是调控巨噬细胞表型转变的重要参与者。例如,人类巨噬细胞特异性存在的lincRNA Mac ORIS主要位于细胞质中,敲低Mac ORIS能够增强巨噬细胞中IFN-γ诱导的JAK2和STAT1的磷酸化,这表明Mac ORIS能够阻断IFN -γ信号转导,抑制巨噬细胞M1型极化[21]。Cao等[22]通过微阵列分析发现,lncRNA-MM2P是唯一在M1型巨噬细胞中下调但在M2型巨噬细胞中上调的lncRNA。进一步研究发现,lncRNA-MM2P能够通过调节 STAT6 的激活,促进IL-13 或IL-4刺激的巨噬细胞 M2型极化。而Han等[23]研究发现,在IL-4 刺激的小鼠骨髓来源的巨噬细胞中,核定位lncRNA PTPRE-AS1与WDR5直接结合,激活受体型酪氨酸磷酸酶ε(PTPRE)转录,并通过MAPK/ERK 1/2 通路抑制巨噬细胞M2型极化。此外,Tregs(调节性T细胞)的消耗可能会促使肾脏疾病进展,影响AKI后的肾脏修复[34]。虽有报道lncRNA Flicr、lncEGFR等与Tregs的激活和分化相关,但仍需要更多的证据去阐明这些lncRNAs如何在体内调控适应性免疫细胞的功能以及如何参与肾脏中的慢性炎性反应[24,25]。

四、lncRNAs与肌成纤维细胞活化和间质纤维化

受损的TECs可通过间质转化或以旁分泌方式促使肌成纤维细胞活化,进而促进细胞外基质的聚集,驱动肾脏疾病向纤维化进展,是AKI向CKD转变中的重要环节。lncRNAs则可通过调控肌成纤维细胞形成或调节TGF-β等纤维化相关信号通路参与AKI后的肾脏纤维化进程。例如,在人和小鼠中保守的lncRNA Rian和Miat,被证实能够参与肌成纤维细胞的形成。在小鼠成纤维细胞NIH3T3 细胞中,敲低Rian能够增强纤维化相关基因,如α-SMA、Col1α1、Smad3等的表达,而敲低Miat则会抑制上述纤维化相关基因的表达[27]。Chen等[26]通过建立缺血再灌注诱导的肾脏纤维化小鼠模型,发现lncRNA Gm12840能够通过竞争性结合miR-677-5p,解除miR-677-5p对Wnt1诱导信号通路蛋白(WISP1)表达的抑制,参与TGF-β1诱导的成纤维细胞活化。

TGF-β/Smad是促使肾脏纤维化的核心信号通路[35]。通过在病程早期靶向特定lncRNAs阻断TGF-β/Smad信号转导可能会成为阻断AKI向CKD转变的治疗新策略。Feng等[28]研究发现,在小鼠单侧输尿管梗阻模型中,lncRNA Erbb4-IR在 TECs中显著上调,Erbb4-IR能够抑制Smad7基因的转录从而增强TGF-β信号活性,敲除 Erbb4-IR 则会增加TGF-β1诱导的小鼠TECs 中 Smad7 表达,从而减弱TGF-β1/Smad3 诱导的肾脏纤维化。Wang等[29]研究发现,lnc-TSI在TGF-β1刺激的人TECs中表达明显增加,lnc-TSI可以直接与Smad3结合并抑制其活化(磷酸化),从而阻断TGF-β1/Smad3信号转导,在UUO小鼠模型中过表达人lnc-TSI能够显著改善小鼠肾纤维化病变。当然,也有相关研究报道lncRNAs通过调节其他纤维化相关通路介导AKI向CKD的纤维化进展。如,lncRNA-H19通过调控Wnt/β-catenin信号通路在AKI向CKD转变中诱导肾纤维化[30]。

五、展 望

lncRNAs是AKI向CKD转变进展过程中的关键调控分子,靶向lncRNAs的基因治疗可能会成为未来的新兴领域。利用外源性载体或外泌体定向输送功能性lncRNAs至特定细胞,或使用小干扰RNA、反义寡核苷酸、CRISPR/cas9基因编辑技术等方法敲低或敲除某一lncRNA的表达,或靶向特定lncRNA进行小分子化合物的筛选与开发等针对lncRNAs新疗法的出现,有助于解决AKI向CKD转变这一临床难题,具有临床应用前景。此外,lncRNAs在不同的细胞类型和肾脏疾病的不同阶段中具有显著的差异化表达,血液或尿液中的外泌体lncRNAs有希望被开发为诊断或预测AKI向CKD进展的生物学标志物。目前,国内外虽有极少的文献报道lncRNAs可以作为肾脏疾病临床诊断的标志物,但目前还尚无文献报道lncRNAs作为生物学标志物指导临床急性肾损伤的转归。由于lncRNAs本身种类繁多、结构复杂、功能多样,甚至在不同物种间保守性差,给临床应用研究带来了极大困难。lncRNAs要成为可靠的生物学标志物或者治疗靶点,仍需进行更多的临床前和临床试验研究予以进一步证实。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。