响应面法优化血糯米花青素提取工艺及抗氧化活性研究

龙弟梅，张月琴，叶雨欣，项慧灵，喻 颖，叶文峰

（宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春 336000）

血糯米，稻米类植物，成熟米粒种皮紫红，口感香甜软糯，又称“黑糯米”。血糯米富含多种营养素，包括丰富的维生素、蛋白质、生物吡咯色素，和钙、镁等常量矿物质元素与铁、铜、锌、硒等微量矿物质元素，研究发现血糯米中含有的脂肪、维生素、氨基酸等营养素均高于普通米的含量[1]。血糯米具有健脾养胃、滋阴益肾、明目补肝、益气强身等方面的功效,是预防疾病、抗衰养颜、健体强身的滋养佳品[2]。

花青素又称“花色素”，在不同pH 条件下呈现不一样色泽的天然色素，是形成花瓣和果实的颜色的重要物质。花青素属于酚类化合物的一种类黄酮化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗衰老、保健皮肤等方面的功效[3]，常见的提取方法有溶剂提取法、水提取法、超声波提取法、树脂法等。

血糯米具有花色苷类(黑色素),经鉴定其主要成分是矢车菊-3-葡糖苷（Cy-3-Glu)，为水溶性红色素[4]。血糯米花青素具有天然色素安全可靠且对环境友好的特点[5]，营养保健，具有良好的开发前景。利用血糯米开发的产品也越来越多样，比如血糯米牛轧糖[6]、血糯米冰淇淋[7]、血糯米软曲奇[8]、血糯桂圆酒[9]等。查阅有关文献发现，当前对血糯米花青素的提取研究分析相对较少，因此本实验选用血糯米为原料，使用溶剂提取法提取血糯米花青素，结合单因素试验以及响应曲面法优化其提取工艺，并考察血糯米花青素抗氧化性能，为血糯米花青素的进一步开发应用提供参考。

1 材料与设备

1.1 实验材料

血糯米，购于江西省宜春市富佳超市；2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）购于Sigma 公司；无水乙醇、盐酸、氯化钾、乙酸钠、过氧化氢、水杨酸、抗坏血酸Vc，购于天津市永大化学试剂有限公司；硫酸亚铁、过硫酸钾购于西陇科学股份有限公司。

1.2 实验设备

CS-1000高速多功能粉碎机CS-1000；HH-2数显恒温水浴锅；SHZ-D(III)循环水式多用真空泵；DHG-9053A 电热恒温鼓风干燥箱；FE28/FE20K 台式数显酸度计；UV752紫外可见分光光度计；SQP电子天平。

2 实验方法

2.1 血糯米花青素提取工艺流程

血糯米干燥→粉碎→过80目筛→乙醇回流提取→抽滤→定容→测血糯米花青素含量

2.2 血糯米花青素提取工艺

市购的血糯米先在设定温度为50 ℃的烘箱中进行干燥，充分干燥后取适量血糯米到粉碎机中进行粉碎处理，过筛。称取1.00 g 血糯米粉，在pH 值为2的条件下进行浸提，并经真空抽滤，得到的血糯米提取液，再用一定浓度的乙醇溶液定容到50 mL，摇匀后避光保存。

2.3 血糯米花青素含量测定与计算

使用pH 示差法[11]测定血糯米花青素的含量，使用公式：

上式中：T是样品总花青素的含量，单位mg/g；A=（A525－A700）pH1.0－（A525－A700）pH4.5，pH1.0代表pH 值为1.0，pH4.5代表pH 值为4.5；A为吸光度；525、700 分别为紫外线波长，单位nm；V是血糯米提取液的总体积，单位mL；m是取样量，单位g；DF是稀释因子；26900 是Cy-3-Glu（矢车菊-3-葡萄糖苷）摩尔消光系数；449.2 是Cy-3-Glu 相对分子质量；L是光程，数值为1 cm。

2.4 单因素实验

2.4.1 乙醇浓度对血糯米花青素提取的影响

分别称取1.00 g样品，样品的料液比设为1 g∶10 mL，分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，在50 ℃的水浴条件下提取60 min，分析不同的乙醇浓度对血糯米中花青素提取的影响。

2.4.2 料液比对血糯米花青素提取的影响

分别称取1.00 g 样品，加入60%乙醇溶液，样品的料液比设成1 g∶10mL、1g∶15mL、1 g∶20mL、1 g∶25mL、1 g∶30 mL，在条件为50 ℃的水浴中提取60 min，分析不同的料液比对血糯米中花青素提取的影响。

2.4.3 提取温度对血糯米花青素提取的影响

分别称取1.00 g样品，样品的料液比为1 g∶10 mL，加入60 %乙醇溶液10 mL，分别在40、50、60、70、80 ℃的水浴下，提取60 min，分析不同的提取温度对血糯米中花青素提取的影响。

2.4.4 提取时间对血糯米花青素提取的影响

分别称取1.00 g样品，样品的料液比为1 g∶10 mL，加入60%乙醇溶液10 mL，在温度为50 ℃的水浴中分别提取15、30、45、60、75 min，分析不同的提取时间对血糯米中花青素提取的影响。

2.5 响应面设计实验

依据单因素试验的结果，固定血糯米花青素的提取时间为45 min，同时把料液比、提取温度、乙醇浓度作为自变量，血糯米花青素含量作为因变量。通过使用Design Expert 8 软件，以及依照Box-Bexhken中心组合试验设计原理，通过展开回归分析处理实验数据，从而获得血糯米花青素提取的最佳工艺参数。

2.6 血糯米花青素体外抗氧化分析

2.6.1 羟自由基清除率

清除羟基自由基活性测定试验采用水杨酸法[12]，对提取后的花青素和VC 配制成不用质量浓度梯度，同时设置空白组和对照组，对其吸光值的测定。

羟自由基的清除率：

2.6.2 ABTS自由基清除率的测定

ABTS 自由基清除率实验测定，参照只德贤等[13]的测定方法，对提取后的花青素和VC 配制成不用质量浓度梯度后进行其吸光值的测定。

ABTS自由基的清除率：

3 结果与分析

3.1 花青素得率的单因素试验及结果

3.1.1 不同乙醇浓度对血糯米花青素提取的影响

乙醇浓度对血糯米花青素提取的影响见图1。

图1 乙醇浓度对血糯米花青素的影响

提取的血糯米花青素的含量会随着乙醇体积分数的升高而增大。当乙醇浓度达到50%时，此时花青素含量最高，再增大乙醇体积分数，提取的花青素含量会降低。这也许是因为乙醇浓度上升，部分会同花青素一起竞争与乙醇－水分子结合的机会的醇溶性杂质以及亲脂性比较强的物质溶出量增多[14]，或乙醇浓度超过了一定的阈值，使花青素溶解性下降，致使血糯米花青素含量下降。所以，选择最佳的乙醇体积分数为50%。

3.1.2 不同料液比对血糯米花青素提取的影响

料液比对血糯米花青素提取的影响见图2。

图2 料液比对血糯米花青素的影响

溶剂提取的血糯米花青素含量会随料液比的增加逐渐增大，当料液比是1 g∶25 mL 时最大，进一步增加料液比，花青素含量明显下降。可能由于水分增加而提高了溶液的溶氧量，溶液发生氧化反应。提取溶剂用量增加，血糯米粉同溶剂的接触面积会增大，使花青素的溶出更加有利，当处于饱和状态时，提高溶剂的用量，会提取出一些不利的杂质且会增添成本。并且，增多提取溶剂的用量，会使花青素浓度降低，从而致使分子间作用力减小，花青素稳定性被直接降低了[15]所以，选择最佳的料液比1 g∶25 mL。

3.1.3 不同提取温度对血糯米花青素提取的影响

提取温度对血糯米花青素提取的影响见图3。

图3 提取温度对血糯米花青素的影响

可以看出，如果温度大到一定程度后再增大，血糯米花青素的含量会下降，当温度达到70 ℃时，提取的血糯米花青素含量最多。由于温度上升，提升了分子运动速度，其扩散、渗透与溶解速度也会提高，则血糯米花青素浸出速度会加快，提取含量增多[16]。进一步升高温度，提取的花青素含量反而下降，可能是温度过高造成色素氧化，血糯米色素结构破坏，发生降解，稳定性降低。所以，选择最佳的提取温度为70 ℃。

3.1.4 不同提取时间对血糯米花青素提取的影响

提取时间对血糯米花青素提取的影响见图4。

图4 提取时间对血糯米花青素的影响

因为花青素的不稳定性，花青素提取45 min效果最好，随时间的延长，提取的花青素含量呈现下降趋势。因为空气氧化作用会造成花青素分解，使色素含量下降；随提取时间延长，血糯米花青素的溶出量增加，花青素溶解达到饱和时，提取率不再上升；提取时间过久，会出现不必要的杂质，花青素的纯度下降[17]。所以，选择最佳的提取时间为45 min。

3.2 响应曲面优化实验

3.2.1 响应曲面实验设计及结果

依据单因素实验的结果，使用Box-Bexhken中心组合设计，设乙醇浓度、料液比、提取温度当做自变量，设计三因素三水平响应曲面实验，提取液中的花青素含量是响应值，因素同水平见表1，做响应面实验，设计及结果见表2、表3。

表1 响应曲面设计试验因素与水平

表2 响应曲面法试验结果

表3 响应曲面二次多项式模型的方差分析

3.2.2 提取含量模型建立与分析

本实验各因素与响应值之间的函数关系的回归方程为：Y=0.21+1.000E-003×A+2.500E-004×B-0.012×C+2.500E-004 ×AB-6.25E-003 ×AC+9.75E-003 ×BC-0.015×A2-0.015×B2-0.026×C2。Y，提取含量；A，乙醇浓度；B，料液比；C，提取温度。由方差分析可知，模型P＜0.000 1 极显著，失拟项P=0.140 8＞0.05 不显著，R2=0.982 8，校正拟合度（R2adj=0.960 6）与展望拟合度（R2pred=0.796 4）一致性较好，说明实验数据的置信度较高、该回归方程可有效拟合各因素与响应值间的关系。C（提取温度)、BC（料液比与提取温度）的P＜0.01，表明C（提取温度)、BC（料液比与提取温度）对血糯米花青素提取影响极显著，AC（乙醇浓度与提取温度）的P＜0.05，说明AC（乙醇浓度与提取温度）对提取含量的影响显著；比较各因素的F值，C（提取温度)＞A（乙醇浓度）＞B（料液比），说明影响提取含量起主要作用的是提取温度，乙醇浓度的作用占第二位，料液比的作用最小。进一步说明此模型可以较好的反映响应值的改变和回归方程的有效性。

3.2.3 响应曲面结果分析

根据回归方程得到的数学模型，通过Design-Expert软件绘制由各因素交互作用构成的响应曲面图，并进行分析。

乙醇浓度和料液比对提取含量交互影响如图5所示，固定提取温度为零水平。从图a响应曲面及图b等高线可知，表明响应值受乙醇浓度同料液比的交互作用不明显。料液比为在1 g∶22 mL～1 g∶26 mL范围内达到最大值。固定料液比，血糯米花青素的提取含量在乙醇浓度大小为在45%～55%。范围内提前含量达到最大值。

图5 （a）乙醇浓度和料液比的交互项响应面图面及（b）等高线

醇浓度和提取温度对提取含量交互影响如图6所示，由图6 中的图a 可知，提取含量随着乙醇浓度的增加呈先增加后降低的趋势，当乙醇浓度较低时，随着提取温度的增加，血糯米花青素提取含量呈先增加后平缓，当乙醇浓度较高时，随着提取温度的增加，血糯米花青素提取含量先增加后降低，从图b 可以看出，提取含量随提取温度在等高线方向跨度大于乙醇浓度，说明提取温度对提取含量的影响大于乙醇浓度，且当乙醇浓度在45%～55%，提取温度在65～75 ℃范围内，提取含量达到最大值。

图6 （a）乙醇浓度和提取温度交互项响应面及（b）等高线图

提取温度和料液比对提取含量交互影响如图7所示，由图a可知，血糯米花青素提取含量随着提取温度的增加先增加后降低，随着料液比的增加，血糯米花青素提取含量先增加后降，由此说明二者之间存在显著的交互作用，从图b能够看出，提取含量随提取温度在等高线方向跨度大于料液比，说明提取温度对提取含量的影响大于料液比，且当料液比在1 g∶22 mL～1 g∶28 mL，提取温度65～75 ℃范围内，提取含量达到最大值。

图7 （a）料液比和提取温度交互项响应面图面及（b）等高线

3.2.4 验证性试验

根据软件得出最佳工艺条件为：乙醇浓度为51%，料液比1 g∶25 mL、提取温度为67 ℃。为了检验实验方法与结果的有效性，对血糯米花青素的取进行验证试验，通过进行3次重复试验，确定血糯米花青素的最优结果，测得血糯米花青素含量的实际平均值为0.216 mg/g，与预测值提取含量为0.224 mg/g 相差在5%范围内，进一步验证了此回归模型具有良好的适用性，表明优化结果具有合理性。

3.3 血糯米花青素体外抗氧化性实验结果

由图8、图9 可知，在一定质量浓度范围内，随着浓度的增加血糯米花青素和VC 对OH、ABTS+清除率增加,但血糯米花青素对OH、ABTS+清除能力均低于VC，当VC 质量浓度为2 g/L 时，对OH、ABTS+清除率均超过90%，相同浓度下血糯米花青素对OH、ABTS+清除能力分别为68.9%、71.84%，即对ABTS+清除力较强。这主要因为花青素对不同自由基清除机理不同以及受花青素纯度影响[20]。

图8 清除羟自由基实验结果

4 结论

血糯米花青素和VC 对羟自由基、ABTS 及DPPH的自由基清除率见图8、图9。

通过用单因素实验与响应面分析法，以血糯米作为原材料，花青素含量为评价指标优化血糯米花青素提取的工艺。同时，以乙醇为提取溶剂，可以去除一些水溶性杂质，具有价格便宜、毒性小、提取液黏度小、易过滤、浓缩方便等优点。最后得到血糯米花青素的最优提取工艺条件为乙醇体积分数51%、料液比1 g∶25 mL、提取温度67 ℃、提取时间45 min。用提取得到的血糯米花青素进行体外抗氧化性实验，发现其具有一定抗氧化活性。