基于网络药理学和分子对接分析二氢血根碱抗氧化的作用机制

张琦，陈敬财，王渝，贾清馨，郭延垒，阳勇，王云红*，张成江

（1.遵义医科大学，贵州 遵义 563099；2.重庆市中药研究院，重庆 400065；3.成都中医药大学，四川 成都 610032）

多刺绿绒蒿（Meconopsis horridulaHook. f. et Thoms.）是罂粟科绿绒蒿属植物，是享誉海内外的珍稀高山花卉，具有“高山牡丹”的美称［1］。《晶珠本草》中记载“刺尔恩”味苦，功效清热，具有接骨、活血化瘀、止痛的作用，为治头创伤最有疗效之药，藏医中多用于治疗头伤、骨折、跌打损伤等，临床上多以复方形式入药［2］。多刺绿绒蒿主要的化学成分有黄酮类化合物、生物碱和挥发性成分等。研究表明绿绒蒿属植物中大概有42种生物碱，其中生物碱类成分主要含有二氢血根碱、小檗碱、去甲血根碱、原阿片碱等。

氧化应激（Oxidative stress，OS）是由于细胞和组织中活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）的产生速度远高于机体清除速度，从而造成大量ROS积累在体内各处并引发组织器官的氧化损伤［3］。研究显示，OS调节失衡会对患者脑组织造成持续损伤，在阿尔茨海默病（AD）患者认知功能受损的发展过程中发挥着促进作用［4］；OS在甲状腺相关性眼病（TAO）的发病过程中也发挥着重要作用［5］，组织缺氧以及活性氧参与了眼眶纤维脂肪组织和眼外肌的改变［6］；同时OS也是造成放射性肺损伤（RILI）的主要原因，放疗产生的ROS对肺纤维化和放射性肺炎都有促进作用［7］；而帕金森病（PD）的发病过程与小胶质细胞过度激活引发的OS和神经炎性反应密切相关［8］；OS也是支气管肺发育不良（BPD）主要发病机制之一。当机体内产生的ROS过多时，会干扰细胞代谢，损害细胞结构，诱导肺泡上皮细胞损伤、调亡等，最终导致BPD的发生［9］。因此，AD、TAO、RILI、PD和BPD的发病均与氧化应激密切相关。有研究表明多刺绿绒蒿中的总生物碱具有较强的抗氧化活性，其抗氧化活性强于维生素C［10］。有研究表明，二氢血根碱的生成是血根碱在体内代谢的主要途径，而血根碱具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、增强免疫力及促进动物生长等作用［11］。课题组前期研究，二氢血根碱为多刺绿绒蒿的特征成分。故本文采用高效液相色谱法对多刺绿绒蒿中二氢血根碱的含量进行测定，通过薄层层析-生物自显影（TLC-bioautography）技术判定其抗氧化活性，通过网络药理学筛选二氢血根碱干预氧化应激性疾病的潜在成分和作用靶点，分析潜在靶点参与通路，解释二氢血根碱辅助治疗以上5种氧化应激性疾病的作用机制，为多刺绿绒蒿中生物碱治疗氧化应激性疾病的基础药理学提供方向和参考。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂与仪器

二氢血根碱（AF21020914，成都埃法生物科技有限公司）、多刺绿绒蒿（采集地点：江孜；由重庆市中药研究院刘翔副研究员鉴定为正品）、10 cm × 10 cm薄层板（青岛海洋化工有限公司）、甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）、乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）、其余实验所用试剂均为分析纯。

BSA224S万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；VGT-2013QTD型超声机（昆山市超声仪器有限公司）；HH-ZK6恒温水浴锅（巩凡市予华仪器有限公司）；UPR-II-20L型超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱（上海龙跃仪器设备有限公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（Waters 2849 UV/Vis Detector Waters Empower化学工作站）。

1.2 多刺绿绒蒿中二氢血根碱的含量测定

1.2.1 色谱条件与系统适应性条件

以为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，三乙胺醋酸溶液为流动相B，按下列表1进行梯度洗脱；检测波长为280 nm，理论板数不低于3 000。

表1 梯度洗脱表Tab.1 Gradient elution table

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取二氢血根碱对照品适量，加乙腈配成质量浓度为0.311 mg/mL的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末（过二号筛）5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇100 mL，称定重量，回流处理1 h，滤过，放冷，称定重量，减少的重量用乙醇补足，过滤，取滤液50 mL于蒸发皿上，蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至10 mL，过0.22 μm的微孔滤膜，作为供试品溶液。

1.2.4 测定方法

分别精密吸取供试品与对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，测定，即得。

1.3 TLC-bioautography分析多刺绿绒蒿的抗氧化活性成分

1.3.1 供试品的制备

取本品粗粉5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加60%乙醇50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，即得。

1.3.2 对照品的制备

精密称取二氢血根碱对照品适量，加甲醇配成质量浓度为1.244 mg/mL对照品溶液。

1.3.3 TLC-bioautography的薄层条件

按照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验，吸取“1.3.1、1.3.2”项下制备的样品溶液各10 μL，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以环己烷： 乙酸乙酯： 二乙胺（18.5： 1： 0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，日光下检视；置紫外光灯（254 nm）下检视；喷以0.1%的2，2-联苯基-1-苦肼基自由基乙醇溶液，晾干，37℃孵化20 min，置于日光下检视。

1.4 网络药理学

1.4.1 软件与数据库

数据库：Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）、SuperPred（https://prediction.charite.de/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org）、PubChemCompound（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、STRING（https://stringdb.org/）、UniProt（https://www.uniprot.org）、Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）。

1.4.2 二氢血根碱成分靶标收集

通过PubChem数据库查找相应SMILES，通过Swiss Target Prediction数据库（设定Probability* ＞ 0为筛选条件）和SuperPred数据库（设定Probability ≥ 50%为筛选条件）获取二氢血根碱的主要化学成分靶点，最后两个数据库结果取并集。

1.4.3 疾病靶标收集

分别以“Alzheimer Disease、Thyroid associated ophthalmopathy、Radiation induced lung injury、Parkinson's disease、Bronchopulmonary dysplasia”作为关键词，按照相关性得分（Relevance score ≥ 10）作为筛选条件，利用GeneCards数据库对疾病的靶标进行筛选；利用OMIM数据库对疾病的靶标进行收集，最后两个数据库结果取并集。

1.4.4 PPI网络的构建及核心靶标的筛选

将成分靶标和AD、TAO、RILI、PD、BPD靶标共同导入到韦恩图Venny 2.1.0中，绘制韦恩图获取交集，对有效作用靶标进行筛选，同时利用STRING数据库，构建PPI网络（combined_score ＞ 0.7）。将筛选后的靶标导入Cytoscape 3.7.1软件中进行可视化分析，构建“药物靶标-疾病靶标”相互作用网络。

1.4.5 KEGG通路富集分析

为进一步明确二氢血根碱与AD、TAO、RILI、PD、BPD交集靶标具体的功能以及在相关通路中的作用，应用Metascape数据库以人类为研究对象，对核心靶标进行KEGG通路富集分析，解析二氢血根碱的潜在作用机制。

1.4.6 分子对接验证

取PPI网络中以Degree、Closeness、Betweenness为条件筛选的29个核心靶标作为受体蛋白，以二氢血根碱作为配体分子。通过PubChem数据库下载二氢血根碱的2D结构，然后使用Chem Draw 20.0.0.41软件对其进行结构优化，并将2D结构转化为3D结构，将文件保存为*.mol2格式，使用Discovery Studio 2019 Client软件对配体进行三维结构转化同时加氢、产生异构体；使用PDB数据库下载29个受体蛋白结构，并将文件保存为*.pdb格式，然后用Discovery Studio 2019 Client软件对其进行蛋白修饰，去除靶蛋白中水分子等非蛋白成分以及配体。使用Discovery Studio 2019 Client软件对以上两个文件进行CDocker分子对接和LibDock分子对接，CDocker分子对接主要根据配体与受体相互作用的能量（-CDocker Interaction Energy，-ECD）进行评价，LibDock分子对接主要根据对接打分（Lib-Dock score）进行评价。

2 结果与分析

2.1 多刺绿绒蒿中二氢血根碱的含量测定

2.1.1 标准曲线的绘制

取1.2.2项下制备的对照品溶液适量，逐级稀释，配制成系列对照品溶液，按照1.2.1项下的色谱条件测定其峰面积，以对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表2。

表2 标准曲线Tab.2 Standard curve

2.1.2 供试品的含量测定结果

多刺绿绒蒿（由重庆市中药研究院刘翔副研究员鉴定基原）中二氢血根碱的含量测定结果为0.50 mg/g，结果见图1～2。

图1 二氢血根碱对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of dihydrosanguine reference substance

图2 绿绒蒿供试品色谱图Fig.2 Chromatogram of Artemisia selengensis test sample

2.2 TLC-bioautography分析多刺绿绒蒿的抗氧化活性成分

根据实验结果（图3）可知，薄层板本身无抗氧化活性，因此呈紫色背景，而对照品和供试品显现黄白色斑点，表明其具有良好的抗氧化活性。由实验结果还可分析出，在多刺绿绒蒿供试品中除了二氢血根碱具有抗氧化活性，还含有其他未知抗氧化活性成分，有待于进一步分离鉴定。

图3 生物自显影色谱图Fig.3 Bioautoradiography chromatogram

2.3 网络药理学

2.3.1 化学成分靶标分析结果

基于Swiss Target Prediction数据库（设定Probability* ＞ 0为筛选条件）和SuperPred数据库（设定Probability ≥ 50%）获取二氢血根碱的主要化学成分靶点，合并去除重复值后，共得到靶标180个，结果导入Cytoscape 3.7.1绘制二氢血根碱靶点图，结果见图4。

图4 二氢血根碱成分靶点图Fig.4 Target diagram of dihydrosanidine composition

2.3.2 疾病靶标分析结果

基于GeneCards数据库分别搜索AD、TAO、RILI、PD和BPD的相关靶标，共得到14 919个靶标，以Relevance score ＞ 10为参数指标，共得到2 732个靶标；基于OMIM数据库，搜索AD、TAO、RILI、PD和BPD疾病相关靶标，共得到2 003个靶标，将两个数据库得到的靶标合并去除重复值后共得到4 424个疾病相关靶标。

2.3.3 PPI网络的构建及核心靶标的筛选分析结果

将180个二氢血根碱相关靶标与4 424个疾病相关靶标取交集，两者交集共有99个靶标，结果见图5。将99个靶标导入到STRING数据库中进行蛋白质相互作用分析（PPI），根据PPI得分（得分 ＞0.7），初步筛选关键靶标蛋白，然后导入Cytoscape 3.7.1中，移除网络中边缘的蛋白，进行蛋白质相互作用网络构建，结果见图6。图中圆的大小和标签字体大小根据Betweenness数值决定，Betweenness数值越大，圆和标签字体就越大，紫色的圆代表Betweenness值由大到小排列的前四分之一靶标，蓝色的圆代表剩余靶标。根据 PPI 网络图分析可知，HSP90AA1、ITGB1、CDK1、CREBBP、PIK3CA等靶点可能是二氢血根碱治疗AD、TAO、RILI、PD、BPD的关键靶点。

图5 二氢血根碱靶点与疾病靶点韦恩图Fig.5 Venn diagram of dihydrosanidine target and disease target

图6 药物靶标-疾病靶标相互作用网络图Fig.6 Drug target disease target interaction network diagram

通过Cytoscape 3.7.1中CytoNCA插件对网络的拓扑性质进行分析，分别以degree、closeness、betweenness 3个拓扑参数的中位数为阈值（分别为5、0.369 975 85、47.069 280 5）对其进行筛选，最终获得29个相互作用的核心靶标，结果见表3，绘制29个核心靶标作用图和化合物-核心靶点-疾病图，结果见图7 ～ 8。

图7 核心靶点网络图Fig.7 Core target network

图8 二氢血根碱-核心靶点-疾病图Fig.8 Dihydrosanguine core target disease diagram

表3 29个核心靶点Tab.3 29 core targets

2.3.4 KEGG通路富集分析结果

基于Metascape数据库对筛选出的29个核心靶标进行KEGG通路富集分析，共获得116条信号通路，取按Log P分组的第一条通路绘制通路条形图，结果见图9。图中条形的长度代表Log 10（P）值的大小，条形颜色根据P值着色。

图9 通路条形图Fig.9 Channel bar chart

取Log P值最小的前20条通路进行如下分析，结果见表4，表中Log 10（P）值代表该通路与疾病的相关强弱，Log 10（P）值越小代表相关性越强；数量值代表该通路富集的靶标个数，数值越大表明富集的靶标越多。

表4 核心靶标KEGG通路富集分析Tab.4 Enrichment analysis of core target KEGG pathway

根据以上分析结果，将化学成分、疾病靶标及其富集得到的信号通路，导入 Cytoscape 3.7.1软件绘制“化合物-靶标-通路”网络图，结果见图10，其中粉色代表二氢血根碱，紫色代表核心靶标，蓝色代表信号通路，连线代表成分、靶标和信号通路之间的关系。对所得结果进行网络拓扑结构分析，可知有HSP90AA1、ITGB1、CDK1、CREBBP等29个核心蛋白靶标，对应二氢血根碱成分，以及Pathways in cancer，PI3K-Akt signaling pathway，Neurotrophin signaling pathway，Lipid and atherosclerosis等20条通路。

图10 化合物-靶标-通路图Fig.10 Compound target path diagram

2.3.5 分子对接分析结果

采用Discovery Studio 2019 Client软件中的CDocker模块和LibDock模块，对关键化学成分进行分子对接验证，29个关键靶点均可进行CDocker对接，24个关键靶点可进行LibDock对接，5个不可进行LibDock对接。CDocker和LibDock打分，结果见表5。取两个模块都可以对接的靶点进行CDocker 3D作图，结果见图11。

图11 CDocker 3D图Fig.11 CDocker 3D

表5 分子对接结果Tab.5 Results of molecular docking

3 讨论

OS的核心是线粒体受损，从而释放大量活性氧，破坏细胞内氧化还原的平衡。目前，已有大量文献表明AD、TAO、RILI、PD和BPD的发病机制均与OS密切相关［12-16］。据《藏药志》中记载，绿绒蒿属植物可有效清除体内的过氧自由基，另外还有研究表明全缘叶绿绒蒿植株或花的提取物也可以清除多种自由基，在治疗氧化应激方面疾病具有良好的前景。经课题组前期研究，二氢血根碱为多刺绿绒蒿的特征成分，故本文旨在研究多刺绿绒蒿中二氢血根碱治疗氧化应激性疾病的作用机制。

3.1 蛋白质相互作用分析

蛋白质相互作用网络表明HSP90Aal、PIK3CA、MAPK10、CDK5等可能是二氢血根碱通过抗氧化作用治疗AD、TAO、RILI、PD和BPD的关键靶点。其中MAPK10蛋白是MAP激酶家族的成员，MAP激酶充当多种生化信号的整合点，因此参与多种细胞过程，例如增殖、分化、转录调控和发育；PIK3CA的突变与多种癌症的发生密切相关；抑制HSP90的表达，可减少炎症反应，HSP90AA1为HSP90的一种亚型。有研究表明HSP90AA1可调节PI3K/Akt信号通路。

3.2 KEGG通路及分子对接分析

由KEGG通路分析可知，与氧化应激有关的重要通路有脂质和动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、PI3K-AKT信号通路（PI3K-AKT signaling pathway）等。PI3K/Akt通路是调节细胞生命历程的重要信号通路。在应激状态下，苏氨酸激酶（Akt）被激活，通过磷酸化促凋亡蛋白以避免激活细胞凋亡途径，在促进细胞存活方面发挥着重要作用。研究发现，通过作用于PI3K/Akt介导的Nrf2信号通路可保护MC3T3-E3和IPEC-J2细胞免受氧化应激的伤害，减少细胞内ROS并降低细胞凋亡率［17］。经分子对接结果显示，关键活性成分与关键靶点间具有较好的结合活性，进一步验证了该研究的预测较为可靠。

4 结论

本研究基于实验验证、网络药理学及分子对接，对绿绒蒿中二氢血根碱治疗氧化应激性疾病潜在作用机制进行了分析。经高效液相色谱法测定多刺绿绒蒿中二氢血根碱的含量为0.50 mg/g；通过体外抗氧化实验证明了二氢血根碱具有良好抗氧化性；通过网络药理学和分子对接技术探索可知二氢血根碱可能是通过调控HSP90Aal、PIK3CA、MAPK10、CDK5等靶点，经AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、PI3K-AKT signaling pathway、Lipid and atherosclerosis等信号通路发挥作用。本研究结果可为今后多刺绿绒蒿治疗氧化应激性疾病提供参考。