阴沟肠杆菌的耐药性分析及氨基糖苷类相关耐药基因的初步研究

王勇 毛真之 王雪芬 卜劲松

阴沟肠杆菌（enterobacter cloacae，Ecl）是肠道内正常的菌群，也是医院常见的致病菌种［1-2］。氨基糖苷类抗生素是临床较早使用的抗生素之一，是临床治疗革兰阴性菌感染的常用药物，其具有广泛的抗菌谱、良好的杀菌效果以及与其他抗生素的良好协同作用等优势［3］。临床常用药物包括阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素等，是目前指南上推荐的多种革兰阴性菌联合治疗药物之一。为了解本院Ecl 耐药相关情况，通过回顾近3年Ecl 的耐药率，及对氨基糖苷类修饰酶（AMEs）基因、16S rRNA 甲基化酶基因、I 类整合子基因等耐药基因进行研究，为提高抗炎效果、降低抗炎成本、避免临床耐药株产生为目的的临床用药提供更好的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2019 年1 月至2021 年12 月本院临床分离的无重复Ecl，总计184 株，其中痰标本88 例，分泌物标本28 例（涵盖创口、脓液、分泌物、脓液及积液），尿液标本19 例，无菌体液标本9 例（含胆汁、透析液、胸腹水），血液标本13 例，导管标本12 例，其余标本5 例。本次实验采用德国Bruker 的MALDITOF 质谱仪进行鉴定，使用的质控菌株包括大肠埃希菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、粪肠球菌（ATCC29212）、白色念珠菌（ATCC700324）。

1.2 仪器试剂 法国生物-梅里埃公司VITEK2 COMPACT 药敏仪及VITEK2 AST-GN16 药敏纸，测试包括阿莫西林/克拉维酸（AMC）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）、头孢唑啉（CZO）、头孢西丁（FOX）、氨曲南（ATM）、厄他培南（ETP）、阿米卡星（AMK）、庆大霉素（GEN）、妥布霉素（TOB）、环丙沙星（CIP）、左旋氧氟沙星（LVX）、复方新诺明（SXT）、呋喃妥因（NIT）、替加环素（TGC）14 种抗菌药物。英国OXOID的亚胺培南（IPM）、美罗培南（MEM）药敏实验纸片。Bruker 的MALDI-TOF 质谱仪（Microfiex LT/SH）。北京天根的细菌质粒DNA 提取试剂盒。引物参考刘晓丹［4］的文献由上海Invitrogen 公司合成，PCR 扩增仪和凝胶成像分析系统为美国BIO-RAD 公司产品。

1.3 耐药基因检测 共检测了9 种基因，其中AMEs 基因6 种：aac3-Ⅱ、aac3-Ⅲ、aac6'-Ⅰb、aph3'-Ⅵ、ant2''-Ⅰ，ant3''-Ⅰ，16SrRNA 甲基化酶基因2 种：armA、rmtB 和I 类整合子基因intI。使用试剂盒提取细菌质粒DNA，PCR 扩增目的基因，反应体系为：ddH2 O 25μL、模板DNA 2μL、10μmol/L 的上、下游引物各1.5μL、Premix Taq 酶20 μL，总共50μL，设定反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性50 s，57℃退火50s，72℃延伸10 min，30 个循环。扩增产物采样2%琼脂糖凝胶电泳后成像观察结果。

1.4 统计学方法 采用WHONET5.6 进行耐药数据分析。

2 结果

2.1 184 株阴沟肠杆菌药敏结果 2019 年至2021 年AMC 的耐药率＞82.8%，且耐药率持续增长，最高为92.4%；TZP 的耐药率＜12.3%；CZO、FOX 的耐药率均＞92.2%；ATM 的耐药率为25.8%～28.1%；碳青霉烯类抗菌药物（ETP、IPM、MEM）的耐药率从2019 年的全敏感到2021 年ETP 的耐药率10.8%，三种药物的耐药率呈现逐年增高趋势；氨基糖苷类抗菌药物（GEN、TOB）的耐药率＜7.6%；喹诺酮类抗菌药物（CIP、LVX）的耐药率＜13.6%；SXT 耐药率逐年下降，从2019 年21.9%到2021 年7.6%；NIT 耐药率＜12.2%；3 年中无AMK和TGC 耐药株检出，见表1。

表1 2019-2021年阴沟肠杆菌对常见16种抗生素的耐药率（%）

2.2 9株氨基糖苷类耐药株药敏结果 9株氨基糖苷类耐药Ecl 对常见16 种抗生素的药敏试验结果显示，其中9 株对GEN 均耐药，6 株对TOB 耐药，无AMK 耐药株，详见表2。

表2 9株氨基糖苷类耐药株对常见16种抗生素的耐药情况

2.3 耐药基因检测结果 184 株Ecl 共检测出7 种耐药基因。其中，9 株氨基糖苷类耐药株共检测出AMEs基因5 种，16RsRNA 甲基化酶基因1 种和int Ⅰ，未检出aac3-Ⅲ、rmtB 基因；非耐药株检测出ant2''-Ⅰ，ant3''-Ⅰ和int Ⅰ3 种耐药基因，见表3。

表3 184株阴沟肠杆菌相关耐药基因检出率

2.4 氨基糖苷类耐药株表型和基因型的符合情况 9株氨基糖苷类耐药株中除2 株未检出任何耐药基因外，其余7 株至少检出1 种耐药基因。175 株非耐药株中有27 株检出至少1 种耐药基因，而148 株未检出任何耐药基因，耐药表型与基因型的符合率为 84.24%。

3 讨论

肠杆菌科细菌是临床感染的主要病原体之一，Ecl是其中第三大常见菌，是常见条件致病菌之一［5］。本资料结果显示，样本来源主要为呼吸道标本，主要分布科室为ICU 和外科，这一结果与目前国内多数文献资料报道一致，符合其是条件性致病菌，容易感染免疫力低下或免疫屏障受到破坏的宿主的特征［7］。通过对药敏结果的分析，发现Ecl 对CZO 的耐药率最高，3 年均＞95.3%，对ETP、IPM、MEM 敏感性较好，虽有逐年上升的趋势但仍＜10.8%，与本院往年结果［7］和我国近年肠杆菌科细菌耐药数据基本一致［5］，对AMK、GEN、TOB 耐药率＜7.6%，和绍兴地区整体耐药率相似，优于CHINET 2021 年公布的14.1%。这与本院较少使用氨基糖苷类抗生素，且持续加强对抗生素的使用管理、普及正确抗生素使用观和加强院感防控等措施有关。值得注意的是9 株耐药株皆对GEN 耐药但对AMK 敏感，且有5 株同时对碳青霉烯类耐药，占耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌的45.45%，7 株同时耐CIP、LVX，5 株对SXT耐药，提示本院耐氨基糖苷类Ecl 均为多重耐药菌株，因此耐药基因检测对快速阻断耐药菌株的院内传播有着积极作用。

AMEs 是Ecl 耐氨基糖苷类抗生素最主要的耐药机制［8］。AMEs 基因多位于整合子、转座子等可移动的基因元件上，为耐药菌株的广泛传播提供先天条件［9］，包括乙酰转移酶（AAC）、核苷转移酶（ANT）、磷酸转移酶（APH）这3 大类，分别以aac6'-Ⅰb、aph3'-Ⅵ、ant2''-Ⅰ和ant3''-Ⅰ最常见，具有游离氨基乙酰化、游离羟基核苷化和游离羟基磷酸化的作用［5］。本研究中，耐药株中共检测5 种AMEs 基因，以aac6'-Ⅰb 检出率最高，为66.67%，未检出aac3-Ⅲ基因，16RsRNA甲基化酶基因只检出arnA，未检出rmtB，综合相关报道［10-14］，虽然在检测耐药基因的选择上、基因检出情况上有所不同，但涉及AMEs 基因的，均以aac6'-Ⅰb检出率最高，而16RsRNA 甲基化酶基因则多为arnA 和rmtB 共同检出。考虑AAC 是革兰阴性细菌的主要抗性来源，目前发现的4 种同工酶中，仅aac6 是宽谱酶，可修饰多种氨基糖苷类抗生素。aac6 以aac6'-Ⅰb 最常见，而aac6'-Ⅰb 基因编码的氨基糖苷修饰酶又是导致GEN、TOB 等失效的重要因素，从而也验证了这两种氨基糖苷类抗生素耐药率高于AMK，故检出率最高，而其他相关基因检测结果的差异，可能与细菌谱、医师用药习惯、患者病情、医院消毒措施等有关。

整合子的特殊性在于其能捕获并整合外源性基因。在Ecl 中广泛存在I类整合子，其构象包括两端的5'、3'保守端和中间的可变区，其功能在于一方面可以与多个耐药基因结合，另一方面其自身启动子也可表达出对抗生素的多重耐药现象［15］。本研究共检测出31 株携带I 类整合子基因，其中9 株氨基糖苷类耐药株中检测出7 株，175 株氨基糖苷类敏感株中检测出24 株，均为各组检出率最高的基因型。检出的7 株携带intI 的氨基糖苷类耐药株中，有6 株检测出AMEs 基因和或16S rRNA 甲基化酶基因，这与其他实验中I 类整合子与氨基糖苷类耐药基因密切相关的结果相一致［16］。

本资料显示，部分耐药株未检测出相应的耐药基因，应考虑到其它耐药机制、基因存在等因素，有待继续深入研究。本院Ecl 氨基糖苷类耐药菌株数较少，在耐药基因反应上可能有一定局限性。本院Ecl 应更多的关注在临床抗感染治疗中可能存在的多重耐药问题。医院对抗菌药物使用的规范化管理，严格按照药敏结果使用抗菌药物，同时积极加强临床耐药菌株监测，避免经验用药、滥用药物，从而遏制多重耐药菌株的产生。