预测艰难梭菌感染的列线图模型构建

王丽倩 单继康 赵丰 杜一芃 周远弟 王贤军

艰难梭菌为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，艰难梭菌感染（Clostridioides difficile infection，CDI）的临床症状包括腹泻、伪膜性肠炎、中毒性巨结肠、败血症甚至死亡等［1］。近年，与 CDI 相关的发病率和死亡率急剧上升，这使得艰难梭菌成为新兴病原体之一，CDI 患者死亡率6.9%～16.7%［2-3］。然而，由于目前我国艰难梭菌实验室诊断能力不足［4］，且检测成本昂贵，导致艰难梭菌检测无法在临床常规开展。因此，分析腹泻患者中CDI 的高危因素，建立预测模型初筛CDI，对于降低CDI 的漏检率有重要意义。本研究拟通过腹泻患者的常规检查如粪常规、血常规和血生化，评估腹泻患者中CDI 的高危因素，并建立列线图预测模型。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2015 年8 月至2019 年7 月浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院1,055例腹泻患者的临床资料。纳入标准：腹泻＞48 h；腹泻＞3 次/d。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法（1）收集资料：包括性别、年龄、粪常规、血常规和血生化等指标。（2）艰难梭菌培养鉴定：①标本接种：挑取200 μL 腹泻样本于EP 管中，加800 μL无水乙醇通过漩涡振荡至混匀。静置1 h 后将装有腹泻样本的EP 管以8,000 rpm/min 离心4 min，弃上清，加0.9%氯化钠溶液500 μL 稀释液悬浮沉淀物，将其倒入艰难梭菌选择性培养基涂布。将培养基和厌氧发生指示剂放于厌氧罐，将厌氧罐置于37℃的CO2培养箱厌氧培养48 h。②质谱鉴定：采用直接涂布法，即挑取可疑菌落（灰色中等大小，边缘不整齐，略凸起表面粗糙的菌落）涂布于加样平板上，覆盖70%甲酸1 μL，待其干燥后再覆盖1 μL 基质液（HCCA 溶液）。待基质液干燥后，将加样板放入质谱仪检测。质谱仪采集相对分子量2,000～20,000 Da 样本蛋白图谱，通过Bruker Biotyper 3.0 软件与数据库进行比较，自动显示鉴定结果。③菌株保存：使用无菌棉棒挑取分纯后的菌株，混匀溶解于含20%甘油的BHI 培养液，放置于低温冰箱-70℃保存。（2）艰难梭菌分子学检测：参照《分子克隆实验指南》和Qiagen 试剂盒说明提取艰难梭菌基因组DNA 模板，毒素基因 tcdA 和 tcdB 使用先前报道的引物序列［5］通过传统的聚合酶链反应进行测定。（3）CDI 诊断标准：参照《中国成人CDI 诊断和治疗专家共识》［6］，CDI 诊断标准：患者出现中至重度腹泻或肠梗阻，并满足以下任一条件：（1）粪便艰难梭菌毒素或产毒艰难梭菌结果阳性；（2）内镜下或组织病理检查显示伪膜性肠炎。

1.3 统计分析方法 采用SPSS22.0 统计学软件。采用多因素Logistic 分析筛选CDI 的危险因素，将该危险因素引入R 软件构建列线图，并绘制受试者操作特征（ROC）曲线预评估模型区分度。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDI 患者与非CDI 患者检验资料比较 两组患者中性粒细胞百分比、总蛋白、白蛋白和钾离子浓度差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 CDI患者与非CDI患者检验资料比较［n（%）］

2.2 腹泻患者中CDI 发生危险因素的多因素logistic 回归分析中性粒细胞百分比、总蛋白浓度和钾离子浓度是腹泻患者中CDI 发生的独立危险因素（P＜0.05）。见表2。

表2 腹泻患者中CDI发生危险因素的多因素Logistic回归分析

2.3 腹泻患者中CDI 发生风险列线图模型的建立 将腹泻患者中CDI 发生的危险因素和前期研究发现的独立危险因素年龄（＞55 岁）［5］纳入R 软件构建列线图预测模型，各因素积分之和对应的预测概率即为腹泻患者中艰难梭菌为致病菌的风险值。列线图显示，腹泻患者中艰难梭菌为致病菌的风险：年龄＞55 岁为30 分，中性粒细胞＜70%为97 分，总蛋白＜65 g/L 为58 分，钾离子浓度＜3.5 mmlo/L 为57 分。见图1。列线图预测腹泻患者中CDI 的ROC 曲线下面积为0.717。见图2。

图2 列线图预测腹泻患者中CDI的ROC曲线

3 讨论

艰难梭菌引起的腹泻在国外尤其北美洲、欧洲和澳洲屡见不鲜。近年来，亚洲地区的日本、韩国及我国也相继出现多种基因型的CDI 病例［7］。因此有必要在临床常规开展产毒型艰难梭菌检测。但我国艰难梭菌临床检测费用昂贵，操作复杂，严重制约该检测在临床广泛开展，从而影响CDI 的诊疗工作［8］。前期研究已发现艰难梭菌分型与腹泻严重程度的相关性［9-10］，同时建模已在临床诊断中逐渐开展应用［11］。

列线图通过整合不良事件发生风险，对不良事件的贡献度进行可视化展示，临床可针对列线图筛选出的高危患者给予个体化预防措施。本研究结果显示，中性粒细胞百分比、总蛋白浓度和钾离子浓度是腹泻患者中发生CDI 的独立危险因素，基于上述独立危险因素和文献中报道的高龄危险因素［5］建立列线图预测模型，ROC 曲线下面积为0.717。表明该列线图预测腹泻患者中CDI 的发生风险具有一定的临床指导价值。

本研究显示，患者总蛋白含量与CDI 发生率密切相关。该结果与KUMARAPPA 等［12］研究相符，CDI 患者常伴随低总蛋白，一方面由于腹泻导致蛋白流失，另一方面低总蛋白会增加患者面临CDI 的风险，因低蛋白伴随低白蛋白或低血清免疫球蛋白，而低免疫球蛋白导致患者抗毒素抗体免疫反应差，阻碍了宿主对艰难梭菌的免疫反应，从而导致艰难梭菌在患者肠道内大量增殖而致病［13］。本研究发现低钾离子与CDI 发生率有关，由于腹泻导致钾离子流失。本研究中CDI 患者的阳性率为17.2%，高于金大智等［5］报道的10.0%，低于程敬伟等［14］报道的24.3%，目前国内外有关CDI 的发生率差异较大，提示我国CDI 可采用早发现早治疗的方法降低院感，从而进一步降低发生率。

综上所述，基于腹泻患者中CDI 的危险因素建立的列线图预测模型具有较好的区分度，可为CDI 的初筛提供一定的指导，早发现、早诊断、早治疗。后期拟计划将列线图预测模型通过大数据用于腹泻患者中筛选CDI。