乳腺癌肥胖患者的生物学特征分析

李海龙 宋佳青 丁海宁 高秀飞

据全球癌症统计数据显示，乳腺癌为全球发病率最高的癌症［1］。研究认为，BMI＞35 kg/m2比BMI＜25 kg/m2的女性发生浸润性乳腺癌的风险高58%［2］。肠道菌群和血清代谢物检测是常用的研究不同证型和体征与疾病进展的重要方法［3］。目前较多研究采用HPLC-MS 等代谢组学技术检测不同进展期的乳腺肿瘤患者差异代谢物及相关性分析［4］。肠道菌群与肠道环境处于相互制约、相互依存的平衡状态，共同组成肠道微生态系统，这与整体观念干预疾病是共通的。既往研究证实肥胖湿邪内困的患者，肠道微生态的平衡破坏，菌群多样性下降［5］；同时乳腺癌的发生发展与肠道菌群的变化密切相关［6］。本研究基于16s rRNA 高通量测序和非靶向代谢组学，探讨肥胖BC 患者肠道菌群和血清代谢物的差异及相关的代谢通路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2021 年1 月至2023 年1 月浙江省中医院乳腺癌患者11 例，其中正常体质量乳腺癌患者6 例，肥胖乳腺癌患者5 例，另收集5 例健康者（健康对照组）的粪便样本及一般资料。乳腺癌的诊断标准依据《乳腺癌临床诊断专家共识》。（1）纳入标准：①女性，年龄18～65 岁；BMI：16～28 kg/m2。②符合乳腺癌中西医诊断标准；③健康对照人群经乳腺彩超证实无明显乳腺病变。（2）排除标准：①病例资料不完整；②患有活动期恶性肿瘤或肺部感染、急性冠心病等疾病；患有严重肠道疾病，如肠易激综合征、溃疡性结肠炎等；③留取标本前3 个月服用过抗生素或益生菌等影响肠道菌群的药物；留取标本前服用激素或免疫抑制剂；④有手术、放疗或化疗史。三组一般资料比较，见表1。本研究经医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

表1 三组一般资料比较

1.2 方法（1）16s rRNA 检测肠道菌群：采用E.Z.N.A.soil DNA kit（omega bio-tek，norcross，GA，U.S.）进行微生物群落DNA 抽提。PCR 产物由AMPure XT beads（beckman coulter genomics，danvers，MA，USA）纯化，Qubit（invitrogen，USA）定量。对16S rRNA 基因V3～V4 可变区进行PCR 扩增后建库，使用NovaSeq 6,000 测序仪进行测序。（2）血清非靶向代谢物检测：取20μL 样品加入50%甲醇120μL 中，震动充分混匀，提取样品中的代谢物，常温静置10 min。提取液放-20℃过夜，沉淀样品中的蛋白质。4,000 g 离心20 min，转移上清液代谢物提取液至96 孔板。每个样品等量取出10μL 稀释液混合成QC 样品，转移至进样小瓶中上机分析。数据采集使用液质联用，液相体系为SCIEX，UK 公司的超高压液相，高分辨率质谱仪为TripleTOF5600plus（SCIEX，UK）。液相色谱柱温设置为35℃，流速为0.4 mL/min。采用的流动相为A 相：水（1%甲酸）；B 相：乙腈（1%甲酸）。液相梯度设置 为：0～0.5 min，5%（B）；＞0.5～7 min，5%～100%（B）；7～8 min，100%（B）；＞8～8.1 min，100%～5% B；＞8.1～10 min，5%（B）。Proteowizard 的MSConver 软件将原始文件转换成mzXML 文件，应用metaX 软件结合KEGG、HMDB 数据库进行物质注释。采用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）进行代谢物多变量分析，得到每个代谢物的变量重要性（VIP）。取FC＞2 倍差异、校正P＜0.05、VIP＞1 为筛选条件得到显著差异代谢物。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计软件。符合正态分布计量资料以（）表示，组间比较用单因素方差分析，偏态分布用秩和检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别多样性分析 Alpha 多样性结果显示（见图1A）：与健康对照组比较，乳腺癌正常体质量组及肥胖患者observed 指数差异无统计学意义（P＞0.05）；与乳腺癌正常体质量组比较，肥胖患者observed 指数差异无统计学意义（P=0.07）。Beta 多样性NMDS 分析结果显示（见图1B）：三组NMDS stress=0.09 时，提示不同组别样本间有较好的区分。

图1 三组多样性分析

2.2 肠道菌群群落组成分析 结果显示，Top30 优势微生物，其中丰度最高的前5 名分别是拟杆菌属（Bacteroides），粪杆菌属（Faecalibacterium），大肠杆菌志贺菌（Escherichia-Shigella），双歧杆菌（Bifidobacterium），Prevotella_9。乳腺癌肥胖组有益菌（Bacteroides、Faecalibacterium，Prausnitzii、Bifidobacterium）明显降低，条件致病菌克雷伯菌属（Klebsiella）丰度明显升高。见图2。

图2 三组属水平肠道菌群分布特征

2.3 肠道菌群属水平差异物种分析 与健康对照组比较，乳腺癌正常体质量组属水平g_Megasphaera 丰度升高（P＜0.05）；乳腺癌肥胖组属水平有5 种肠道菌属（g_Lachnospiraceae_NC2004_group、g_Megasphaera、g_Catenibacterium、g_Holdemania、g_Chloroplast_unclassified）丰度升高（P＜0.05）。与健康对照组比较，乳腺癌正常体质量组属水平有10 种肠道差异菌 属（g_Chloroplast_unclassified、g_Romboutsia、g_Incertae_Sedis、g_Negativibacillus、g_UCG-005、g_Colidextribacter、g_Paraprevotella、g_Actinomadura、g_Pseudoflavonifractor、g_Eubacterium_hallii_group）丰度降低（P＜0.05）。见图3。与乳腺癌正常体质量组比较，乳腺癌肥胖组属水平22 种肠道菌属（g_Colidextribacter、g_Lachnospiraceae_NC2004_group、g_Anaerotruncus、g_Oscillibacter、g_Ruminococcus、g_UCG-003、g_Klebsiella、g_Desulfovibrio、g_Christensenellaceae_R-7_group、g_Negativibacillus、g_Enterobacter、g_Eubacterium_xylanophilum_group、g_UCG-005、g_Butyricimonas、g_Oscillospiraceae_unclassified、g_Pseudoflavonifractor、g_Holdemania、g_Eubacterium_oxidoreducens_group、g_Bacteroidota_unclassified、g_Eubacterium_coprostanoligenes_group_unclassified、g_Phascolarctobacterium、g_Mitochondria_unclassified）丰度升高（P＜0.05），其中g_Klebsiella 丰度最高，且丰度增加301.8 倍；g_Phascolarctobacterium 丰度增加11.49倍。见图4。

图3 三组肠道菌群属水平差异分析

图4 乳腺癌患者肠道菌群属水平差异分析

2.4 肠道菌群与临床指标关联分析 相关性分析结果显示：ALT 与g_Holdemania、g_Anaerotruncus、g_Oscillibacter、g_Oscillospiraceae_unclassified、g_Phascolarctobacterium、g_UCG-003、g_Colidextribacter 丰度呈正相关（P＜0.05，P＜0.01）；BMI 与g_Holdemania、g_Lachnospiraceae_NC2004_group、g_Ruminococcus、g_Enterobacter、g_Anaerotruncus、g_Oscillibacter、g_Oscillospiraceae_unclassified、g_Phascolarctobacterium、g_UCG-003、g_Bacteroidota_unclassified、g_Colidextribacter、g_Incertae_Sedis 丰度呈正相关（P＜0.05，P＜0.01）；AST 与g_Bacteroidota_unclassified 丰度呈正相关（P＜0.05）。LDL 与g_Paraprevotella 丰度呈负相关（P＜0.01）。见图5。

图5 临床指标与肠道菌群属水平相关性分析

2.5 不同组别血清代谢物差异分析 采用PLS-DA 模型对三组血清代谢物轮廓进行判别分析，得到模型得分散点图。不同颜色和形状的散点代表不同的分组，包围散点的椭圆表示95%置信区间。乳腺癌正常体质量组与健康对照组、乳腺癌肥胖组与健康对照组、乳腺癌肥胖组与乳腺癌正常体质量组样本散点完全分离。见图6。

图6 三组PLS-DA分析及热图分析

2.6 血清代谢物KEGG 通路富集分析 根据PLS-DA模型，乳腺癌正常体质量组和健康对照组比较，共有170 种（下调42 种、上调128 种）差异血清代谢物（P＜0.05），主要富集在氨基酸代谢、D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢、鞘磷脂代谢、丙酮酸代谢、丁酸代谢、维生素B6 代谢、氮硫代谢等通路（P＜0.05）（见图7A）；乳腺癌肥胖组和健康对照组比较，共有130 种（下调61种、上调69 种）差异血清代谢物（P＜0.05），主要富集在花生四烯酸代谢通路（P＜0.05）（见图7B）；乳腺癌肥胖组和乳腺癌正常体质量组比较，共有160 种（下调97 种、上调63 种）差异血清代谢物（P＜0.05），主要富集在初级胆汁酸生物合成、氨基酸生物合成与代谢、单巴坦生物合成、牛磺酸和低牛磺酸代谢、亚油酸代谢烟酸和烟酰胺代谢、2-草酸代谢通路（P＜0.05）（见图7C）。

图7 三组血清差异代谢物通路分析

2.7 不同组别血清胆汁酸含量分析 KEGG 通路分析发现，乳腺癌正常体质量组与肥胖患者在初级胆汁酸代谢途径方面具有显著变化，进一步对血清中不同胆固醇含量及成分进行分析，结果显示血清代谢物中与胆汁酸代谢物相关的有5 种，包括脱氧胆酸（Deoxycholic acid）、异胆酸（Isolithocholic acid）、胆酸（Cholic acid）、熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic acid）、鹅去氧胆酸24-acyl-beta-D-glucuronide（Chenodeoxycholic acid 24-acylbeta-D-glucuronide）。与健康对照组比较，乳腺癌正常体质量组Deoxycholic acid 水平降低（P＜0.05）。与乳腺癌正常体质量组比较，乳腺癌肥胖组Cholic acid 水平下降（P＜0.05）。见图8。

图8 三组血清胆汁酸含量分析

2.8 胆汁酸与肠道菌群关联分析 相关性结果显示：胆酸与g_Eubacterium_coprostanoligenes_group_unclassified 丰度呈负相关（P＜0.05）；鹅去氧胆酸24-acyl -beta-D-glucuronide 与g_Fusicatenibacter、g_Erysipelatoclostridium 丰度呈负相关（P＜0.05）；脱氧胆酸与g_Anaerostipes、g_Megasphaera 丰度呈负相关（P＜0.05，0.01）。脱氧胆酸、异胆酸与g_NK4A214_group呈正相关（P＜0.05，0.01）；异胆酸与g_Alistipes 呈正相关（P＜0.05）。见图9。

图9 属水平肠道菌群与血清胆汁酸代谢物相关性分析

3 讨论

肠道菌群紊乱可通过影响宿主的代谢等促进疾病的发生发展［7］，随着相关研究的深入，发现乳腺癌的发生发展与肠菌群的变化存在内在关联［8-9］。较多研究发现改善肠道菌群紊乱，可通过调节炎症反应、雌激素通路［10］以及肠源性代谢产物等发挥抗乳腺癌作用［11］。本研究发现，与健康对照组比较，乳腺癌正常体质量组属水平g_Megasphaera 丰度升高（P＜0.05）；乳腺癌肥胖组属水平g_Lachnospiraceae_NC2004_group、g_Megasphaera、g_Catenibacterium、g_Holdemania、g_Chloroplast_unclassified 丰度升高（P＜0.05）。与乳腺癌正常体质量组相比，乳腺癌肥胖组高表达的差异肠道菌有22 种，其中g_Klebsiella 丰度最高，且丰度增加301.8 倍；g_Phascolarctobacterium 丰度增加11.49倍。g_Klebsiella 是被公认的有害菌［12］，与炎症、肥胖等密切相关；同时研究发现乳腺癌术后痛的患者肠道Phascolarctobacterium 升高［13］。进一步相关性分析发现在22 种差异菌群中，g_Anaerotruncus、g_Holdemania、g_Oscillibacter、g_Oscillospiraceae_unclassified 等与ALT呈正相关；g_Bacteroidota_unclassified 与AST 呈正相关；g_Anaerotruncus、g_Bacteroidota_unclassified、g_Enterobacter、g_Holdemania 等与BMI 呈正相关。提示乳腺癌肥胖存在肠道菌群的差异。

研究表明超重和肥胖是乳腺癌的危险因素［14］，而在不同体质量亚型中，多种血清代谢物与菌群相关［15］，提示不同体质量患者中，肠道菌群改变可引起多种代谢通路的代谢物表达异常［16］，同时这也可能与乳腺癌等肿瘤的进展密切相关。CHEN 等［17］进行不同个体间血浆代谢产物与肠道菌群相关性研究，结果显示血浆中208 种代谢物可与314 种微生物因子间建立4212 种关联，包括硫胺素、雌激素等代谢产物。本研究发现，乳腺癌正常体质量组和健康对照组比较，共有170 种（下调42 种、上调128 种）差异血清代谢物，主要富集在氨基酸代谢、D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢、鞘磷脂代谢、丙酮酸代谢、丁酸代谢、维生素B6 代谢、氮硫代谢等通路。有研究发现作为丰富的循环氨基酸，谷氨酰胺是癌细胞的关键碳和能量来源，其与乳腺癌等癌症发生发展密切相关［18］；另有研究发现乳腺癌小鼠较正常小鼠相比，丙酮酸、磷脂等16 种代谢产物明显变化［19］。

乳腺癌肥胖组和健康对照组比较，共有130 种（下调61 种、上调69 种）差异血清代谢物，主要富集在花生四烯酸代谢通路。乳腺癌肥胖组和乳腺癌正常体质量组比较，共有160 种（下调97 种、上调63 种）差异血清代谢物，主要富集在初级胆汁酸生物合成、氨基酸生物合成与代谢、单巴坦生物合成、牛磺酸和低牛磺酸代谢、亚油酸代谢烟酸和烟酰胺代谢、2-草酸代谢通路。LIN 等［20］采用气相色谱-质谱法分析乳腺癌患者血清代谢组，结果显示丙氨酸、谷氨酰胺代谢差异物发生显著变化，与本研究结果一致。研究表明原代胆汁酸生物合成途径是与乳腺癌患者疾病进展密切相关的代谢途径［21］。本研究进一步对乳腺癌患者与健康对照组胆汁酸和肠道菌进行相关性分析，发现胆酸与g_Eubacterium_coprostanoligenes_group_unclassified 丰度呈负相关；鹅去氧胆酸24-acyl -beta-D-glucuronide 与g_Fusicatenibacter、g_Erysipelatoclostridium 丰度呈负相关；脱氧胆酸与g_Anaerostipes、g_Megasphaera 丰度呈负相关。脱氧胆酸、异胆酸与g_NK4A214_group 呈正相关；异胆酸与g_Alistipes 呈正相关。