基于网络药理学研究丹栀逍遥散治疗便秘的作用机制

林铭钐, 林建国, 林明莹, 张笑霄, 张晴, 朱婷婷, 姚魁武,4

1.中国中医科学院广安门医院,北京 100053;2.北京中医药大学,北京 100029;3.西安理工大学,陕西西安 710048;4.中国中医科学院眼科医院,北京 100040

便秘(constipation)是一种常见的消化系统症状,表现为排便困难、排便次数减少、粪便干硬症状中的至少一种。研究表明,便秘会增加冠心病和缺血性卒中的发病风险,相较于非便秘人群,有基础性疾病便秘人群的死亡风险更高[1-2]。

中医认为,邪滞肠胃,糟粕内停,大肠传导失司为便秘的主要病理机制,其中气机郁滞、阴亏血少是其主要证候,患者多有情志不调,肝气郁结,导致腑气郁滞;或素体阴虚,阴血亏少不足以荣养。临床相关研究显示,以逍遥散为基础方治疗便秘能够增强结肠动力,提高传输功能和胃肠排空率,从而改善临床症状[3-4]。本文基于网络药理学研究丹栀逍遥散治疗便秘的作用机制。

1 材料和方法

1.1 丹栀逍遥散中活性成分和靶点的筛选

通过TCMSP(http:tcmspw.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php)分别查找柴胡(CH)、白芍(BS)、甘草(GC)、当归(DG)、茯苓(FL)、白术(BZ)、牡丹皮(DP)、栀子(ZZ)的化学组成成分。TCMSP筛选条件为口服利用度≥30%,且药性≥0.18;BATMAN-TCM筛选条件为靶点预测得分值≥50,初步筛选丹栀逍遥散的有效活性成分,并根据文献中中药的主要有效成分进行补充完善[5-7]。用化学成分对应的靶蛋白在Uniprot蛋白质数据库(http://www.uniprot.org/)中规范蛋白靶点且匹配标准基因名称,查重后删除重复值和无靶点的化学成分。

1.2 便秘相关靶点检索和筛选

在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/home/)、治疗靶点数据库(therapeutic target database,TTD)(http://db.idrblab.net/ttd)的疾病基因数据库中,以“constipation”为关键词检索便秘的相关靶点,汇总后去重得到疾病靶点。

1.3 构建药物-化合物-靶点-疾病网络和蛋白互作网络

在微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn)对药物与疾病靶点取交集,绘制文氏图,并在Cytoscape3.8.0构建药物-化合物-靶点-疾病网络,利用内置Network Analyzer和cytoHubba功能分析网络,推测丹栀逍遥散的有效活性成分。用丹栀逍遥散与便秘的交集靶点,在STRING(http://stringdb.org/)数据库上构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络并导出数据,筛选核心蛋白。

1.4 富集分析

将丹栀逍遥散和便秘筛选去重后的交集靶点导入Metascape平台(http://metascape.org/),对交集靶点进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析,在微生信平台绘制气泡图;在BioGPS平台(http://biogps.org/)检索关键靶点并对其组织、器官特异性表达程度进行分析。

1.5 分子对接验证

在蛋白质结构数据库(protein data bank,PDB)(http://www.pdbus.org)检索筛选出关键靶点合适的PDB ID并下载其pdb结构,在TCMSP平台上下载筛选出有效活性成分化合物的mol2结构。使用SwissDock平台(http://www.swissdock.ch/)进行在线分子对接,根据其结合能评价靶点和有效成分的结合强度。对接能量<0 kcal/mol为小分子配体与大分子蛋白能够自发结合,并且对接能量越低,结合效果越好;当对接结合能量<-5 kcal/mol,为具有较好的结合效果;对接结合能量<-7 kcal/mol为具有较强的结合效果[8]。

2 结 果

2.1 丹栀逍遥散的有效成分和靶点

筛选整合后得到丹栀逍遥散的有效活性成分250个(其中柴胡20个、当归49个、白芍13个、茯苓16个、白术8个、甘草118个、牡丹皮11个、栀子15个),剔除重复后共获得225个有效活性成分,746个药物靶点,其中度值前五的有效活性成分见表1。

表1 丹栀逍遥散的有效活性成分

2.2 便秘相关靶点检索

检索GeneCards、OMIM、DisGeNET、TTD疾病数据库,得到便秘靶点个数分别为5 365(筛选后1 430个)、647、424、9个,筛选并去重后得到便秘靶点1 620个。丹桅逍遥散与便秘的交集靶点为153个(图1)。

图1 丹桅逍遥散-便秘交集靶点文氏图

2.3 丹栀逍遥散治疗便秘的PPI网络与关键靶点

丹栀逍遥散和便秘靶点交集共153个,STRING数据库构建PPI网络见图2。根据度值筛选前4位的关键靶点,分别为VEGFA、CASP3、TNF、JUN。

图2 PPI网络图

2.4 丹栀逍遥散-化合物-靶点-便秘网络结果

共获得351个节点(包含153个靶点和189个有效活性成分)与1 574条关系(图3)。根据cytoHubba筛选前4位的关键成分为槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇。

图3 丹栀逍遥散-化合物-靶点-便秘网络图

2.5 GO富集及KEGG通路结果

GO富集分析包含生物过程、分子过程以及细胞过程。其生物过程主要为对无机物的反应、对外来刺激的反应等;分子过程主要为氧化还原酶活性、信号受体激活剂活性、泛素样蛋白连接酶结合等;细胞过程主要涉及膜筏、线粒体包膜、细胞体等(图4)。KEGG主要通路涉及癌症的通路、血脂和动脉粥样硬化、NF-κB信号通路、AMPK信号通路、炎性肠病等(图4)。

图4 GO富集和KEGG通路气泡图

2.6 组织、器官富集分析

对检索结果进行数据分析,发现关键靶点组织特异性表达主要分布在淋巴细胞、平滑肌、肺、结肠、结直肠腺癌、小肠(表2)。

表2 组织、器官富集

2.7 分子对接结果

分别将槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇与VEGFA、CASP3、TNF、JUN进行分子对接。结果显示,β-谷甾醇和TNF以及豆甾醇和CASP3具有较强的结合效果(图5、图6)。

图5 分子对接结合能

图6 分子对接结果

3 讨 论

便秘的病因较为复杂,最常见于药物治疗所引起的症状,也可由多种疾病引起,包括代谢性疾病、肌病、神经系统疾病等,其病理生理学机制尚未完全明确。研究表明[3,9],便秘与多种胃肠道神经肌肉病变、神经内分泌功能紊乱,以及肠道炎症、肠道微生物菌群改变相关。便秘与肛门直肠疾病密切相关,是结直肠癌发生的重要影响因素[10]。

丹栀逍遥散的主要化学成分多为黄酮类、甾醇类,包括槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇等。槲皮素是广泛存在于多种植物中的黄酮醇类化合物,具有抗氧化、抗炎的作用。Kim等[11]发现,槲皮素可刺激便秘大鼠排便,这可能与恢复其mAChRs表达下调及其下游信号,降低Gα、PI3K磷酸化水平,调节胃肠平滑肌,增加肠蠕动功能相关;诱导横结肠分泌黏蛋白,且诱导功能的强弱与膜水通道表达相关;病理组织分析发现其可恢复横结肠的异常结构改变。Liu等[12]发现,槲皮素能抑制便秘模型大鼠的肠杆菌及肠球菌生长,减少乙酸合成为丁酸,保护肠上皮细胞的屏障功能。研究表明,槲皮素可以调节细胞的自噬能力,通过调节P53、AMPK信号通路,灭活HIF-1信号通路抑制细胞增殖,诱导保护性自噬能力,另可通过调节Wnt信号转导途径让细胞失活,失去自噬能力[13]。曲一帆[14]发现,山奈酚可以降低肠道中脂多糖含量,改善溃疡性结肠炎小鼠的临床症状,保护肠黏膜,调节菌群平衡,减轻病理损伤。同时,山奈酚可诱导细胞凋亡,抑制VEGF表达,调节HIF-1α,诱导CASP3依赖性细胞凋亡[15]。Chen等[16]认为,山奈酚可以增加肠道紧密蛋白表达保护肠道物理屏障,增加丁酸盐受体,增强肠上皮屏障功能。β-谷甾醇、豆甾醇均可减少结肠炎小鼠的高炎症表达[17]。Ding等[18]发现,β-谷甾醇可以减缓结肠炎小鼠体质量下降,缩短结肠长度,降低髓过氧化物酶活性,减少结肠TNF-α,改善组织学炎症变化,此外肠上皮抗菌肽的表达显著增加,对致病菌有多重作用。严海冬等[19]发现,β-谷甾醇抑制炎症因子,豆甾醇抑制结肠缩短,降低炎症因子表达,缓解结肠炎的症状,且豆甾醇的抗炎性高于β-谷甾醇。

根据PPI网络筛选的关键靶点有VEGFA、CASP3、TNF、JUN。CASP3作为关键角色参与细胞凋亡、坏死和炎症的信号转导[19]。VEGFA是血管新生和血管生成的关键调节因子。研究发现,在中国汉族人群中,坏死性结肠炎患者的血液中VEGFA水平较普通人低[20]。Frysz-Naglak等[21]发现,肠道上皮细胞如果VEGF产生过多,可能会损伤肠道的屏障,使肠道菌群侵犯肠壁。JUN与癌症的发生密切相关,当积累到一定程度时可促进细胞增殖,但在结肠癌中可被E3泛素连接酶泛素化,继而降解,发挥抑癌作用[22]。TNF-α是重要的促炎因子,改变肠黏膜通透性,破坏肠道[23]。

综上所述,丹栀逍遥散治疗便秘主要涉及槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇等189个有效活性成分,可能通过VEGFA、CASP3、TNF、JUN等关键靶点,调节细胞衰老、炎性肠病、NF-kappa B信号通路等相关通路,从而参与抗炎、保护肠黏膜屏障、调节肠道菌群,改善便秘症状。