低氧微环境增强MACC1调控PI3K/AKT信号通路促进结直肠癌肿瘤干细胞样特性

吴共发, 曾宇婷, 刘钰君, 姚雨江, 邱丽浈

广州医科大学附属第四医院 1.病理科,2.健康管理中心,广东广州511300

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球死亡率居第二的恶性肿瘤[1],导致其治疗失败的主要原因是转移复发[2-3]。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)可导致恶性肿瘤复发、转移、异质性、多药耐药和放射耐药等。低氧被认为是CSC形成和维持的关键成分[4]。已证明低氧通过上调某些因子的表达来促进CRC的转移[5]。结肠癌转移相关基因1(MACC1)是一个很强的预后生物标志物和转移诱导物[6]。前期研究显示CRC中MACC1高表达参与了其恶性进展[7-9],抑制MACC1能阻遏CRC恶性行为[10]。有研究显示MACC1通过PI3K/AKT信号通路促进CRC的CSC样特性[11]。然而,CRC中低氧微环境、MACC1和CSC样特性之间的相互作用机制尚待阐明,本研究探讨了低氧条件对MACC1功能及CRC细胞CSC样特性的影响和机制,以期为寻找CRC新的治疗策略提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 细胞与主要试剂

人结肠癌细胞HCT116购自中国科学院上海细胞库,液氮保存,使用时复苏;MACC1基因过表达克隆慢病毒包装服务委托广州易锦生物技术有限公司完成;即用型抗体ki-67和抗体稀释液购自福州迈新;通用型二抗-HRP聚合物购自Dako公司;Transwell小室购自美国Corning公司;AKT及Phospho-Akt(Thr308)抗体购自美国CST公司;CCK-8试剂盒、蛋白抽提试剂盒、蛋白水平检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和ECL反应检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术公司;MACC1、CD133和CD44抗体购自英国Abcam公司,内参β-actin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;山羊抗兔二抗购自中杉金桥公司,重组人表皮生长因子购自麦克林生化公司;人碱性成纤维细胞生长因子购自艾德莱生物公司;PI3K激动剂740 Y-P购自Bio-Techne公司。

1.2 细胞培养和处理

HCT116细胞常规培养于10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,放置于37 ℃、5%CO2的培养箱中。取对数期生长的细胞用于实验。待对数生长期细胞铺板生长面积达到50%左右,按照慢病毒转染说明书进行操作,以绿色荧光标记的MACC1基因过表达克隆慢病毒颗粒(LV-MACC1)和空载体对照慢病毒颗粒(LV-Ctrl)分别感染HCT116细胞,分别作为实验组(LV-MACC1组)和过表达阴性对照组(LV-Ctrl组),2组常规培养。LV-MACC1组在低氧环境(1%O2、5%CO2和94%N2)培养设为LV-MACC1+hypoxia组,激活PI3K活性实验用30 μmol/L 740 Y-P在37 ℃、5%CO2培养箱下处理HCT116细胞24 h。

1.3 CCK-8和免疫细胞化学法检测细胞增殖

将细胞(5×103个/孔)接种于96孔板中,每组设置5个复孔。待各组细胞处理48 h后,每孔加入10 μL CCK-8液。随后避光在细胞培养箱中孵育4 h,在450 nm处测定样品的光密度(optical density,OD值),计算平均值。收集处理48 h的各组细胞制作细胞块制成石蜡包埋细胞块,方法按照前期研究[12],按照说明书进行免疫细胞化学检测ki-67的表达情况,高倍镜下随机进行5个高倍视野拍照并计数,取均值,ki-67阳性指数(%)=ki-67阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.4 划痕实验

将细胞接种到6孔板中,各组细胞处理后培养至100%融合。随后用200 μL的无菌移液管尖端划一个划痕伤口,并使用PBS清除细胞碎片。细胞在添加了1%胎牛血清的RPMI-1640中孵育至处理时间达48 h。分别在孵育后0、48 h观察划痕伤口,每组设置5个复孔。显微镜下随机选择的视野中捕获图像。

1.5 细胞侵袭实验

将各组细胞2×104个/孔和200 μL无血清基质胶加入上腔,底部腔室添加500 μL RPMI-1640和10%胎牛血清。处理培养48 h后,用70%乙醇固定,0.1%结晶紫染色,用光学显微镜随机拍照5个高倍视野和计数平均值。

1.6 肿瘤球形成试验

将各组细胞1×104个/孔在6孔的超低附着表面培养皿中培养,分组按1.2,每组设置3个复孔。细胞在无血清的DMEM/F12中培养,添加20 μg/L重组人表皮生长因子、10 μg/L人碱性成纤维细胞生长因子和B27添加剂。细胞培养14天后,在倒置显微镜下计数>50 μm3的肿瘤球数。

1.7 Western blotting实验

按照蛋白抽提试剂盒说明书操作获得细胞裂解液,按照蛋白水平检测试剂盒说明书操作测定蛋白水平。随后,用10%SDS-PAGE凝胶分离20 μg蛋白/通道,转移到PVDF膜上。在5%脱脂牛奶中密封2 h后,加一抗MACC1、CD133、CD44、和β-actin(1∶1 000)在4 ℃下过夜,然后与山羊抗兔二抗(1∶5 000)在室温下孵育2 h,用ECL反应检测试剂盒观察。内参为β-actin,使用Image J软件对条带进行灰度值量化分析,蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.8 统计学方法

GraphPad Prism 5.0软件分析实验数据,计量资料采用独立样本t检验,多组比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 结肠癌细胞中稳定过表达MACC1的效果

绿色荧光标记的MACC1基因过表达克隆慢病毒颗粒感染HCT116细胞48 h,倒置荧光显微镜下观察显示接近100%的细胞有绿色荧光。蛋白印迹法条带显示LV-MACC1组的MACC1蛋白表达较LV-Ctrl组明显增强(图1)。

图1 MACC1在慢病毒感染48 h后的表达水平A为感染MACC1慢病毒细胞在明场和荧光场下的图像(200×);B为MACC1蛋白表达。

2.2 低氧及过表达MACC1对HCT116细胞增殖能力的影响

CCK-8法检测结果显示,LV-MACC1组和LV-MACC1+hypoxia组OD值均高于LV-Ctrl组,LV-MACC1+hypoxia组细胞增殖OD值高于LV-MACC1组(P<0.05;图2A)。细胞块免疫细胞化学显示,ki-67阳性指数与CCK-8结果有同样趋势(图2B)。

图2 低氧及MACC1对HCT116细胞增殖的影响A为CCK-8法测细胞增殖能力情况;B为免疫细胞化学ki-67检测细胞增殖情况(400×)。a为P<0.05,与LV-ctrl组比较;b为P<0.05,与LV-MACC1组比较。

2.3 低氧及过表达MACC1对HCT16细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示,过表达MACC1能促进HCT116细胞迁移能力,低氧微环境能进一步增强MACC1促进HCT116细胞的迁移能力(图3)。

图3 低氧及MACC1对结肠癌细胞迁移能力的影响

2.4 低氧及过表达MACC1对HCT16细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示,LV-MACC1组和LV-MACC1+hypoxia组的细胞穿孔数均高于LV-Ctrl组,LV-MACC1+hypoxia组细胞穿孔数高于LV-MACC1组(P<0.05;图4),提示过表达MACC1能促进HCT116细胞侵袭能力,低氧微环境能进一步增强MACC1促进HCT116细胞的侵袭能力。

图4 低氧及过表达MACC1对结肠癌细胞侵袭能力的影响A为光学显微镜下图(结晶紫染色,500×);B为各组细胞穿孔数柱状图。a为P<0.05,与LV-Ctrl组比较;b为P<0.05,与LV-MACC1组比较。

2.5 低氧及过表达MACC1对肿瘤球形成的影响

各组细胞培养14天后计数>50 μm3的肿瘤球数量,LV-Ctrl组、LV-MACC1组和LV-MACC1+hypoxia组的肿瘤球数量分别是(43.8±2.1)个、(63.8±2.5)个和(82.2±2.7)个。肿瘤球数LV-MACC1+hypoxia组>LV-MACC1组>LV-Ctrl组(P<0.05;图5)。

图5 低氧及过表达MACC1对结肠癌细胞肿瘤球形成的影响(200×)

2.6 低氧及过表达MACC1对CD44、CD133及AKT蛋白表达的影响

蛋白印迹法结果显示,CD44、CD133和p-AKT蛋白相对表达量LV-MACC1+hypoxia组>LV-MACC1组>LV-Ctrl组(P<0.05;图6)。

图6 低氧及过表达MACC1对CD44、CD133和AKT蛋白表达的影响1为LV-Ctrl组;2为LV-MACC1组;3为LV-MACC1+hypoxia组。a为P<0.05,与LV-Ctrl组比较;b为P<0.05,与LV-MACC1组比较。

2.7 激活PI3K/AKT通路活性对干细胞标记物的影响

740 Y-P激活细胞PI3K/AKT信号通路活性后,激活后的细胞CD44、CD133蛋白表达较对照组增加(P<0.05;图7)。

图7 激活PI3K/AKT信号通路对CD44、CD133蛋白表达的影响a为P<0.05,与对照组比较。

3 讨 论

尽管外科技术、化疗药物和分子靶向药物取得了新进展,但CRC患者数量却正在逐步增加[1]。至少有三分之一的CRC患者发生肝转移而导致死亡[3]。有研究证实,MACC1可通过多种机制促进CRC细胞进展、耐药,维持CSC特性[13-14]。本研究表明,在结肠癌HCT116细胞中过表达MACC1可诱导促进CSC样特性的发展。本研究结果表明,MACC1表达上调后,除了能促进CRC恶性行为能力,还增强了CSC样标记物CD44、CD133的表达水平和增加了肿瘤球形成,同时PI3K/AKT通路参与了MACC1的上述对HCT116细胞的作用。然而,公认为CRC发生、发展是一个多步骤多因素的复合作用下的不良事件,继续寻找MACC1的协同因素对CRC进展机制的阐明有重要意义。

低氧微环境是CSC形成和维持的关键成分,低氧微环境能诱导CD133等作为CSC的特异性生物标志物的表达[4]。CSC具有3个独特的特性:自我更新、显示亲代肿瘤癌细胞的所有特征、表达一组独特的表面生物标志物[15]。目前的抗肿瘤治疗缺乏对CSC的靶向性,不能导致肿瘤的消退。本研究表明,低氧环境有进一步协调加强MACC1诱导促进CSC样特性的作用和进一步促进肿瘤增殖、迁移和侵袭能力,且PI3K/AKT通路参与其中。CSC是存在于特定的生态环境中的,目前针对CSC的研究,分离出来的CSC大多数脱离了微环境情况下的研究。这提示笔者结合微环境进行CSC的研究可能是更加科学合理的一种方法。

目前CRC中关于低氧微环境与MACC1两者如何相互作用促进CSC样特性的机制尚不明确。低氧微环境已被证实可通过激活PI3K/AKT通路调控诱导多种癌细胞出现CSC样特性[15-17]。这提示低氧微环境和MACC1可能通过某些相同通路共同促进CRC的CSC样特性。本研究结果表明,在MACC1过表达的CRC细胞中,p-AKT表达水平增高,表明PI3K/AKT的激活增强。随后,740 Y-P处理的细胞的CSC标记物表达明显升高。这些结果表明,PI3K/AKT信号通路可能在低氧微环境和MACC1促进结肠癌CSC样特性中发挥关键作用;然而,这一过程具体机制有待进一步研究。

综上所述,MACC1过表达促进CRC肿瘤干细胞样特性出现,并且低氧环境能促进加强这种作用,其中机制通过激活PI3K/AKT信号通路促进CRC细胞出现CSC样特性。针对低氧微环境和MACC1的策略可能是CRC中消除CSC的潜在靶点。但需要进一步的研究来确定低氧微环境和MACC1在肿瘤干细胞样特性中的作用,并了解其潜在的机制。