PET 塑料降解及其降解酶改造方法的研究进展

经楠楠， 刘文红， 李 强， 李青青， 王 霞， 姚建庄

（济南大学 生物科学与技术学院，山东 济南 250022）

“塑料”是一个广义的概念，通常指由聚合物和具有理想性能的化学添加剂组成的材料，常见的塑料有聚丙烯（PP）、聚苯乙烯（PS）、聚乙烯（PE）、聚氯乙烯（PVC）、聚氨酯（PU）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）等[1]。自1950 年开始，塑料大规模投入生产和使用，全球塑料产量呈指数级递增，一些国家和地区开始使用化石原料作为生产塑料的原材料，同时塑料还被广泛应用到食品包装、汽车制造、纺织工艺等行业。随着社会对塑料的需求不断增加，塑料产量也在不断上升。全球塑料年产量由1950 年的200.00 万t 增长至2014 年的3.11 亿t，2022 年又增长至4.00 亿t 左右。研究人员推测，到2050 年塑料的年产量可增长至12.00 亿t[2-3]。PET是日常生活中经常使用的一种塑料，通常由化合物对苯二甲酸和乙二醇经过酯化、缩聚而合成。PET通常以乳白色或浅黄色的半结晶状态或不定型状态存在，其表面光滑，熔点为250～255 ℃，具有较高的耐热性和稳定性[4]。PET 在农业、工业、医学领域都有广泛的应用。随着其应用领域的扩大，其使用量急剧上升，但未经过人工处理的PET 在自然情况下很难被降解，因此对环境损害严重[5-6]。因农业生产而产生的塑料污染问题十分严重，如地膜残留、污水灌溉、污泥农用、有机肥施用以及大气沉降等可造成微塑料问题，尤其是农用地膜，在初步处理后形成微塑料而沉积在土壤中，很难被再次降解。另外，微塑料含有增塑剂等有毒添加剂，且其粒径小，会直接影响自然环境及生物生长，进而影响生态系统的平衡和人类的健康[7-8]。由于塑料化学品在环境中无处不在，人类持续接触塑料化学品已不可避免，塑料对人体和环境的危害越来越大，因此对塑料的有效降解和处理十分必要[9]。生物酶降解法利用日益发展的生物酶技术降解塑料，因其具有绿色、环保等特点，有望被应用于工厂塑料废弃物的降解中。本文主要综述了目前降解塑料的主要方法、生物降解法降解PET 的常用酶以及对相关酶的改造思路，同时对解决相关塑料降解酶的产量低、应用成本高、降解酶表达条件苛刻等问题进行了展望。

1 研究进展

1.1 现阶段降解塑料的主要方法

1.1.1 光降解法

光催化在有机反应中具有一定的优越性，已应用于催化合成反应、污水处理、催化降解等方面[10-11]。光降解法是一种解决“白色污染”的可行而有效的塑料降解方法，塑料经光降解一般变为二氧化碳和水等无害物质。一些塑料经紫外线照射后化学键之间的相互作用减弱，因此机械性能降低，致使塑料分子长链分裂为许多分子质量小的短链，短链在外部作用下继续分解，并被空气中的物质不断还原氧化，最终成为可被自然界生物分解的物质[12]。光降解塑料方法简单，且生产成本低，合成工艺简单。但是，光降解法也存在一定的弊端，其受环境的影响较大。在使用光降解塑料的过程中，塑料堆积或被土壤掩埋，下层塑料接触不到阳光，此时降解过程便不能继续进行，塑料降解量十分受限[13]。

1.1.2 热降解法

热降解法是一种对废弃塑料进行化学回收利用的重要手段，具有许多优势，如物料适用性广、回收资源高效、产品价值高、环境污染小等[14]。该方法对废弃塑料中的高分子聚合物进行加热，使之较彻底地分解而回到小分子或单体状态，从而产出燃料油、固体燃料和不凝天然气等，实现对废弃塑料的资源化、无害化、减量化处置[15-17]。但是，热分解后的回收再利用仍存在一定的弊端，如热分解回收工艺需要在高温下进行反应，设备投资较大，回收成本高；回收再利用的PET 二次产品的冲击强度等力学性能降低，这大大限制了塑料的应用潜力。研究人员对废弃塑料进行了改性，但这无疑又增加了回收成本[18-19]。

1.1.3 生物降解法

生物降解法是通过微生物的作用将塑料解聚为小低聚体碎片的方法[20-23]。生物降解法主要分为微生物降解法和酶降解法。

①微生物降解法。在降解过程中，微生物首先分泌胞外降解酶，将塑料降解为可溶性小分子物质，然后这些小分子物质被微生物吸收至体内；微生物体内分泌的胞内降解酶进一步将这些小分子物质降解为二氧化碳以及水等物质。目前，我国对于塑料的填埋主要采用厌氧填埋的方法，对塑料进行土壤填埋后，再利用土壤中以塑料作为碳源的微生物对塑料进行自然降解[24-25]。

②酶降解法。酶降解法是塑料治污的最佳方法之一。研究人员将能够降解塑料的细菌或能在生物体外发挥作用的酶提取出来，发现这些酶能在体外将PET 降解为对苯二甲酸乙二醇酯（MHET）、对苯二甲酸酯（TPA）、乙二醇（EG）等原料成分。图1 为PET 生物酶降解流程图。目前，酶降解法已成为塑料降解中较有前景的一种方法。

图1 PET 生物酶降解流程图Fig.1 PET bioenzyme degradation flow chart

与其他方法相比，生物降解法的菌种培养条件苛刻、产物提取率低，但其降解速率较高且绿色环保。研究人员对能够降解塑料的酶不断进行突变改造，得到了降解效果较好的PET 水解酶[26]。生物降解法在降解塑料时可极大地减少废水、废气的排放并降低降解成本，具有很强的推广价值。

现阶段降解塑料的主要方法及其优缺点见表1。

表1 现阶段降解塑料的主要方法及其优缺点Table 1 The major methods of plastic degradation and their advantages and disadvantages at present stage

2 生物降解法降解PET的常用酶

2.1 单酶降解PET

2.1.1 脂肪酶

PET 是一种高分子聚合物，其内部由酯键连接，所以研究人员选择作用于酯键的酯酶和脂肪酶对PET 进行水解[27]。酯酶只能改变PET 纤维的亲水性，脂肪酶拥有共同的α/β 水解酶折叠结构、共同的五肽结构（Gly-X1-Ser-X2-Gly）以及保守的催化三联体（Ser-His-Asp）结构[28]。R.J.MÜLLER 等[29]发现源于Thermobifida fusca的脂肪酶TfH 对PET薄膜具有降解活性，可对PET 进行有效的解聚。A.EBERL 等[30]发现源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶也可以用于PET 降解。研究人员还发现，脂肪酶存在类似“盖子”的结构，活性区域被包埋在这种结构中，该结构的灵活性影响脂肪酶的催化活性[31]。脂肪酶的特殊结构覆盖酶的催化中心，阻碍酶与底物的结合，使脂肪酶对底物的催化效果降低。

2.1.2 角质酶

角质酶是一种α/β-水解酶，属于胞外丝氨酸酯酶，能够降解角质并产出脂肪酸单体。由于角质酶在疏水区域中有一条从催化口袋中延伸的长沟槽，而该沟槽能够结合两亲性长链底物，因此角质酶具有降解聚ε-己内酯和PET 的能力，可作用于多聚物的酯键以及其他的长链、短链脂肪酸酯等。目前，对源于腐皮镰刀菌（Fusarium solani）的角质酶的研究较为普遍[32-34]。角质酶的Ser-His-Asp 位于疏水氨基酸组成的凹槽中，用于识别和结合PET[35]。角质酶的活性位点S120 残基包含在保守氨基酸序列（Gly-Tyr-Ser-Gln-Gly）中[36]，这一点与脂肪酶具有高度的同源性。但是，与脂肪酶相比，角质酶具有独特的特征，即Ser-His-Asp 位于蛋白酶三维结构的一端[37]。研究人员发现了一种源自叶枝堆肥的具有较高热稳定性的叶质复合角质酶（LCC），并认为该角质酶的催化中心不存在类似“盖子”的结构，有利于酶识别PET 底物[38-40]。S.SULAIMAN 等[41]测定了由宏基因组衍生的具有PET 降解活性的LCC 的晶体结构，并对其进行了热力学和动力学稳定性测定。结果表明，在PET 的降解过程中，LCC 的活性位点不受热诱导的影响，降解活性较高，LCC 中含有的二硫键有利于其热力学和动力学稳定性。K.N.HELLESNES等[42]在不同的pH 下对源自茄病镰孢的PET 水解角质酶（FsC）的动力学特征进行了表征，发现主要是角质酶活性位点周围的脂肪族侧链与对苯二甲酸酯（BHET）发生相互作用；提出了FsC 对PET 的低催化性能是由于底物结合不良以及MHET 水解缓慢所致；对阻碍FsC 有效水解PET 的原因进行了分析，并提出了解决策略。综上可知，降解PET 的角质酶一般都具有较高的降解活性和热稳定性。

2.1.3 PET 水解酶

PET 水解酶（PETase）是一种经典的α/β 折叠水解酶。S.YOSHIDA 等[43]对源自塑料瓶回收厂的沉淀物、土壤、废水以及活性污泥等250 个样本进行回收和收集，在其中选出了菌株Ideonella sakaiensis201-F6，发现此菌株可以以低结晶度（1.9%）的PET膜作为主要碳源，且可将PET 膜降解为低分子质量的低聚物或单体。相比于其他角质酶，PETase 的活性较高。除了PETase，在Ideonella sakaiensis201-F6菌株中还发现了α/β 水解酶MHETase。MHETase属于单宁酶家族，拥有两个不同的结构域：能够催化α/β 水解酶的折叠结构域和“ 盖子”结构域。MHETase 的活性位点位于两个结构域之间，能够容纳催化三联体（S225-H528-D492）和氧阴离子空穴[44]。在降解过程中，PETase 首先作用于聚合物中的酯键使之水解，产生BHET、MHET 和TPA，MEHTase 可使BHET 和MHET 进一步水解生成TPA 和EG 单体，MHETase 的加入可以降低产物MHET 对整体反应的限制。研究人员通过基因组比对发现，PETase 与TfH 具有51%序列同源性的开放阅读框，其相应的重组蛋白对PET 塑料具有降解活性。在后续研究中发现，PETase 和放线菌角质酶之间也具有45%～53% 的序列同源性[43]。PETase 在蛋白结构上额外拥有1 个二硫键，同时观察到W156 残基具有摆动性，这种摆动性可以使PETase 扩大底物结合口袋以容纳底物[45]。与其他PET 降解酶相比，PETase 降解能力和热稳定性较差。因此，研究人员对PETase 进行改造，开发了热稳定性更强的酶。Y.L.CUI 等[46]发现，PETase 对PET 的降解能力局限于微摩尔水平，降解能力有限，但通过计算机辅助设计将PETase 突变为DuraPETase，DuraPETase 对半结晶PET 薄膜的降解作用显著增强，且热稳定性更强，在60 ℃下孵育3 d 仍能保持较高活性。综合来看，PETase 的热稳定性和降解率仍然偏低。

2.2 混菌或混酶降解PET

混菌或混酶降解PET 是一种较有前景的方法，通过它有望实现PET 废弃物循环经济。与传统纯培养菌株相比，混菌或混酶降解PET 可利用其协同作用以及多种微生物代谢途径的结合，解除降解产物对降解反应的抑制，从而提高PET 的降解率。多酶系统具有成本低、催化效率高的优点。不同的酶在反应体系中的催化模式以及对底物的特异性互补，因此可实现协同作用，从而促进PET 的降解。PETase 和MHETase 的共同作用可构成用于PET完全水解的双酶体系[47]。G.VON HAUGWITZ 等[48]对源自Thermobifida fusca的混杂羧酸酯酶（TfCa）进行了研究，并通过结构引导对底物结合口袋氨基酸残基进行合理改造，得到其突变体I69W/V376A(WA)，将TfCa 或WA 与中亲性PET 解聚酶变体（IsPETase PM）混合，降解了不同结晶度的PET 底物。结果表明，与单一IsPETase PM 相比，具有野生型TfCa 和突变体WA 的双酶系统分别产生高达11 倍和14 倍的TPA。C.ROBERTS 等[49]发现，属于假单胞菌属和芽孢杆菌属的5 个菌株在PET 及其裂解产物BHET 作为碳源时能够协同生长，由整个联合体中提取的分泌酶能够完全将BHET 转化为代谢可用的单体TPA 和乙二醇；同时，菌株之间的代谢可加强降解TPA 和乙二醇的混合酶的能力。综上可知，混菌系统具有在PET 作为唯一碳源的有限营养环境中合作和交叉饲养的能力，利用细菌联合体进行PET 的生物降解可为全球塑料积累提供部分解决方案。表2 为PET 降解酶的来源与特征。

表2 PET 降解酶的来源与特征Table 2 Source and characteristics of PET degrading enzymes

3 PET 降解酶的工程改造

3.1 改造酶底物结合口袋

酶和底物的接触不充分是底物降解速度慢的一个重要因素。W.ZENG 等[50]基于蛋白质结构工程对LCC 的四重突变体（ICCG）进行修饰设计，得到了比亲本酶具有更高功效的突变体，这些突变体可降解具有刚性结构的PET。对突变体进行了酶活性测定。结果表明，突变体活性提高是由于扩大了底物结合通道，增大了酶底物结合口袋，从而增大了酶对PET 的结合能力。Y.MA 等[51]利用PETase 及其底物模型探索了PETase 与底物（PET 单体、对苯二甲酸乙二醇酯的二聚体、2PET）的相互作用，对底物结合凹槽周围的6 个关键残基进行改造，通过蛋白质工程创造了新的高效PETase 突变体。与野生型PETase 相比，突变体PETaseR61A、PETaseL88F 和PETaseI179F 的酶活性分别增加了1.4 倍、2.1 倍和2.5 倍。H.F.SON等[52]对IsPETase 进行基于结构生物信息学的蛋白质工程改造，以优化酶的底物结合位点，改造了酶与底物结合口袋，并开发了IsPETaseS242T 和IsPETaseN246D 两种突变体。结果表明，与野生型IsPETase 相比，突变体IsPETaseS242T 在37 ℃分别孵育24、72 h 后，活性分别比野生型提高了2.5 倍和1.5 倍；突变体IsPETaseN246D 在25 ℃分别孵育24、72 h 后，活性分别提高了1.2 倍和1.7 倍；在37 ℃分别孵育24、72 h 后，活性分别提高了2.6 倍和2.4倍。研究发现，来源于腐皮镰孢菌（Fusarium solani）的FsC 角质酶虽然能够有效水解一些角质和短链脂肪族聚酯，但对于PET 的降解却未表现出较高活性[53]。

R.ARAÚJO 等[54]采用定点诱变的方法对茄灰镰刀菌角质酶TfC 活性位点附近进行了基因改造。结合模型研究发现，改造后TfC 对PET 和聚酰胺6,6（pa6,6）纤维的活性增强，扩大了活性位点，增大了酶与底物结合口袋。结果表明，与野生型突变体相比，突变体TfCL81A 和TfCL182A 对PET 的降解活性分别提高了4.0 倍和5.0 倍。Q.L.DONG等[55]结合计算机辅助设计，模拟角质酶降解低聚聚酯C24H42O8的复合物结构，对角质酶进行突变，得到了突变体L90A 和I213A。这两种突变体位于底物结合位点附近的环中，但不直接与底物相互作用，因此增加了相邻底物相互作用环的灵活性。研究者还通过增加该区域的空白空间，扩大了溶剂可接近的表面积，增大了酶与底物结合口袋，从而间接提高了整体酶的活性。对底物的降解实验结果表明，与野生型酶相比，突变体L90A 和I213A 对底物的水解活性分别提高了5.0 倍和2.4 倍。

3.2 增强酶的稳定性

PET 的玻璃化转变温度为70.00～80.00 ℃，高温下无定形状态的PET 更容易与酶结合而降解，而一些PET 降解酶热稳定性较差，因此增强降解酶的热稳定性至关重要。研究人员利用IsPETase 的结构信息对其进行突变并进行筛选，得到具有高热稳定性的突变体IsPETase（S121E/D186H/R280A），与原始酶相比，其DNA 解链温度（Tm）在40.00 ℃时提高了8.81 ℃，PET 降解活性提高了14.0 倍[56]。LCC 的热稳定性低可能是限制其降解速度的因素，V.TOURNIER 等[57]和曾伟[58]采用分子对接和酶接触表面分析的方法，研究了LCC 活性位点的模型底物2-HE（MHET）3的结合模式，并通过酶工程对可能发挥作用的氨基酸残基进行改造，得到了热稳定性更强的突变体ICCG；在生物反应器条件下对ICCG 进行了评估。结果表明，ICCG 在72 ℃孵育20 h，PcW-PET 的转化率达82.0%，与野生型LCC相比，活性大大提高。H.Y.LU 等[59]基于野生型PETase 和ThermoPETase 晶体结构，利用计算机对其进行突变拟合，得到了单突变体PETaseS121E、PETaseT140D、PETaseR224Q、PETaseN233K 以及其组合突变体。研究表明，突变体PETase（T140D/N233K）的热稳定性变化最大，其Tm为58.10 ℃（ΔTm=10.00 ℃）；突变体DuraPETaseN233K的Tm为83.50 ℃（ΔTm=5.00 ℃），是目前为止报道的最耐热的PETase 突变体，且与野生型突变体相比具有高活性。A.MRIGWANI 等[60]通过分子对接和MD 模拟对TfC 表面的17 个残基进行突变，并进行了动力学和热力学稳定性测定。结果表明，突变体TfCL90F、TfCF209I 和TfCF249R 热稳定性良好，双突变体TfC（G62A/L90F）、TfC（G62A/F209I）和TfC（G62A/F249R）分别表现出对PET 和中间体MHET 降解的最高活性。

3.3 减少酶的产物抑制

PET 能被降解酶降解为BHET、MHET、TPA、EG 等物质，当这些产物积累到一定量时会对酶促反应产生抑制作用。L.PFAFF 等[61]利用分子动力学模拟的方法进行结构分析和计算建模，针对产物抑制和多种底物结合模式对酶促PET 水解的影响关键机制进行了解释：活性位点周围主要疏水残基的构象灵活性可能有助于在生物催化过程中识别底物，增强与BHET、MHET 等产物和PET 底物的亲和力，减少产物抑制，并对嗜热性聚酯水解酶（PES-H）参与酶与底物结合的关键残基进行诱变。结果表明，PES-H 的突变体PES-H（L92F/Q94Y）具有较高的水解活性，在72 ℃时，突变体PES-H（L92F/Q94Y）对无定形PET 薄膜和预处理后的真实PET 废物的水解活性比突变前分别提高了2.3 倍和3.4 倍。M.BARTH 等[62]在EG、TPA、BHET 和MHET 存在的条件下，以PET 薄膜为原材料制备的纳米颗粒被酶水解，使用PET 降解模型确定初始反应速率并对其进行了动力学分析。结果表明，MHET 是TfCut2 对PET 纳米颗粒酶促水解的相关抑制剂。L.K.SU 等[63]将α-synuclein c 端序列的16位残基肽（αSP）融合到ICCG 的c 端，融合酶（ICCGαSP）保持了与ICCG 相同的二级和三级结构，但增强了双（2-羟基乙基）对BHET 和PET 的结合力，在50 ℃孵育3 h,ICCG-αSP 的降解活性是ICCG 的3.9 倍；在降解温度为50～70 ℃、pH 为7.0～9.0 的条件下孵育4 d,ICCG-αSP 的降解活性是ICCG 的1.1～1.5 倍。

4 展 望

为了缓解因塑料污染而引发的问题，国家出台了多项措施。同时，为了使资源得到合理利用，尽可能实现“循环塑料经济”的目标，国内外相关研究人员对塑料降解开展了积极的研究工作。目前，塑料降解酶的研究虽有了一定程度的突破，但仍存在产量低、应用成本高、降解酶表达条件苛刻等缺点，不利于应用到实际生产中，同时也限制了塑料降解酶的规模化生产和应用。因此，对塑料降解的方法以及对相关降解酶进行改造十分必要。由此可作以下展望：①进一步探索废弃塑料的处理方法，解决塑料处理效率低、污染严重的问题，使其向更加经济、绿色和环保的方向发展。②进一步研究生物法降解塑料机理，如某些昆虫、海洋生物等在体内可降解塑料，但其降解机理不明确，其体内是否存在可对塑料高效特异性降解的物质，是否能够人工提取出这些物质或对其进行改造，仍有待考究。③进一步改造塑料降解酶。目前，对塑料降解酶的改造局限于使活性位点突变，从而改变降解酶的底物结合口袋、热稳定性等，可考虑是否能在相关降解酶的活性位点中连接更具活性的侧链或基团进行修饰等，或许可在不改变其属性的基础上大大提高降解能力。④寻找新的降解酶蛋白表达载体。现有的降解酶蛋白表达载体一般选择大肠杆菌、酵母菌等，但存在培养条件苛刻、蛋白表达量低等问题，期望能找到类似生物反应器的一种生物，使该生物能够提高蛋白表达量且可简单便捷地表达蛋白。⑤合成更容易降解的新型塑料。本实验室对PET 的单体进行了改造，并用ICCG 的改造酶对改造后的PET 单体的二聚体进行降解，与原始ICCG 酶相比，改造酶对改造后的二聚体的降解活性明显提高。目前，本实验室正在合成改造后PET 单体的多聚体（即新型塑料），并根据其热稳定性、透明度、硬度等寻找其用途，有望合成更易被降解的新型环保塑料。