一种罗丹明内酰胺类高分子pH荧光探针的合成及性能

李桂贞，胡英元，章博，杨耀祖，翟荣佳，赵鑫

（苏州科技大学化学与生命科学学院，江苏 苏州 215009）

pH 在细胞代谢、离子迁移、酶活性和蛋白质降解等生理过程中起着重要的作用，此项生理参数非常关键[1-4]。多数生物体都不能存活于强碱或强酸条件下，正常的生理条件下，pH 应保持在一个狭窄的范围内，异常的pH 会引起细胞功能障碍，由此引发相关生物体病变，包括癌症、神经退行性疾病（NDD）、阿尔茨海默氏病（AD）与囊性纤维化（CF）等[5-6]，因此研究弱酸或弱碱性环境下pH的变化十分重要。现有技术证明，在酸碱度上，正常细胞和肿瘤细胞的pH 分别为7.4 和6.2～6.9，后者一般偏低，这种pH 上的显著差别可用于肿瘤细胞的识别与诊治[7]。此外，溶酶体是细胞中一类弱酸性细胞器（pH 为4.7～6.5），可降解细胞组分及大分子物质，能够维持细胞稳态[8]。另一方面，生态环境pH 的变化会导致农作物物理干旱，破坏植被组织，阻碍营养吸收等[9-10]。因此，寻找定量测量pH 的有效方法对于疾病诊断和环境监测都具有重要意义。

现今，已有诸多方法皆可用来测定pH，例如电化学测量法、酸碱指示剂滴定法、电位滴定法和光谱学等方法[11-14]。但这些方法对于仪器精度、处理过程有较高要求，对其用于测定细胞pH 有诸多限制。与这些方法相比，小分子荧光探针的长处在于操作简便、高选择性等，但其制备过程相对复杂，与细胞可能存在排异、水溶性问题。近年来，聚合物荧光探针成为了另一研究热点，其在生物相容性与水溶性方面表现更佳，还具有荧光信号强、高灵敏度等优势[15]。目前，现有聚合物荧光探针研究大多是检测金属离子，用于pH 检测的聚合物荧光探针还有待深入研究[16-20]。在实际检测中，待检测物与探针结合会导致荧光增强或荧光猝灭，受猝灭剂等因素影响，猝灭型聚合物荧光探针可能会导致检测结果偏差[21]，增强型聚合物荧光探针的研发意义更加显著。包含内酰胺螺环结构的罗丹明（Rhodamine）类荧光染料分子具有无荧光、无色特性，但对pH 变化有高敏感性，酸性环境下，其螺环结构开环，形成大共轭结构，会发射出荧光量子效率在85%以上的橙红色强荧光[22]。然而，罗丹明内酰胺小分子缺乏良好水溶性，同时常与金属离子形成配位效应或被催化分解，可严重干扰氢离子的荧光响应，所以水溶性表现良好的罗丹明内酰胺聚合物探针的研究具有较大价值。

本文先修饰罗丹明B，使其转变为具有可聚合双键结构的单体，接着与能够穿透细胞膜的水溶性单体共聚，制备出一种高分子pH荧光探针PRAM，此探针具有很好的细胞膜透性与水溶性。且探针PRAM所包含的内酰胺结构中的N原子与吸电子基团相连，使相邻N原子上电子云密度减少，因此不能再与金属离子配合响应，导致分子呈现开环-闭环的临界态，但对H+极为敏感。因此，探针PRAM以丙烯酰胺基团作为响应位点调控罗丹明基团，能够只对H+形成荧光响应，且抗干扰性能突出，其响应机理如图1 所示。该探针pKa值为4.30，可在较快的响应时间下监测细胞器内和水环境中pH 的变化，同时实现了TM3活细胞的荧光成像。

图1 探针PRAM对pH变化的响应机理

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

化学试剂皆为市场中销售的分析纯，若未特定标注，不需要再纯化，可直接使用。实验用蒸馏水为二次蒸馏水。红外谱图采用德国Bruker 公司FTIR-VERTEX 80/80v 傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）；1H NMR 和13C NMR 谱图采用瑞士Bruker公司AVANCE Ⅲ型400MHz 核磁共振仪（NMR）；元素分析用Elementar Vario EL Ⅲ型元素分析仪测定。采用UV-8500 紫外分光光度计测定其吸收光谱；荧光发射光谱采用FLS920 荧光分光光度计；用pHS-3C 型精密pH 计测定pH。采用三次独立测量的平均标准偏差（SD）收集数据。细胞荧光成像采用SZX10型奥林巴斯显微镜检测。

1.2 性能测试

探针PRAM储备液的配制：称取0.1g纯品探针PRAM，溶于蒸馏水中，并移入100mL容量瓶，用蒸馏水定容，配制成1mg/mL的探针测试液。

UV-Vis 测试：取多份1mL 探针PRAM 水溶液（1mg/mL）于25mL的烧杯中，分别调节溶液pH为4.0～9.0，放入10mL 容量瓶，蒸馏水定容，混匀并静置15min，检测UV-Vis谱。

荧光光谱测试：溶液制备参照UV-Vis 测试，以下为检测条件：激发波长（λex）与狭缝宽度各为526nm、5nm。

选择性和干扰性测试方法：取多份1mL的PRAM水溶液（1mg/mL），分别加入1mL浓度为1×10-4mol/L的金属离子水溶液（Fe3+、Cu2+、Pb2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+和Na+），混合均匀，调节pH为5.0或7.0，静置15min，检测其荧光强度。

1.3 细胞成像

控温37℃，在ϕ(CO2)为5%恒温培养箱中，用10%的灭活胎牛血清DMEM 培养基培养TM3 细胞（正常小鼠睾丸Leydig细胞）。把TM3放入DEME高糖培养基[内含10%牛血清（FBS）]，静置培养24h。将其移至24 孔板内接种。待细胞贴壁后，滴加0.5mg/mL浓度的探针，静置培养30min，再加入不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0）的磷酸缓冲液（PBS）培养15min，用PBS 溶液洗涤两次，在荧光显微镜（FM）下成像。

1.4 探针PRAM的合成

使用试剂罗丹明 B、水合肼、丙烯酰氯和丙烯酰胺，经过三步合成得到荧光探针PRAM，其合成路线如图2所示。

图2 PRAM的合成路线

1.4.1 中间体Mrh的合成

根据Minami等[23]和翟荣佳等[24]的方法，合成底物罗丹明B酰肼，得到粉色固体1.83g，产率80.3%。m.p.110.4～112.7℃。1H NMR（CDCl3，400MHz）（δ）：7.95～7.93（d，J= 7.5Hz，1H），7.46～7.44（m，2H），7.12～7.10（d，J= 7.5Hz，1H），6.45～6.47（d，J=7.5Hz，2H），6.41～6.42（d，J= 7.5Hz，2H），6.28～6.31（s，2H），3.61（s，2H），3.32～3.37（q，J=8.0Hz，8H），1.15～1.18（t，J=8.0Hz，12H）。元素分析[C28H32N4O2理论值（实测值）]：C，73.64%（73.61%）； H， 7.07% （7.09%）； N， 12.28%（12.23%）。

取罗丹明B 酰肼0.912g（2mmol）和四氢呋喃（THF）5mL加入到50mL三口烧瓶，冰浴下，把溶于5mL 四氢呋喃的0.2g（2.2mmol）丙烯酰氯滴加到三口烧瓶内，室温条件下反应6h。过滤沉淀，THF 洗涤、干燥，得0.53g 粉红色固体Mrh，收率52.0%，m.p.198.2～200.3℃。1H NMR（DMSO-d6，400MHz）（δ）：9.95（s，1H），8.79（s，1H），7.88～7.86 （d，J= 7.5Hz，1H），7.58～7.54 （m，2H），7.27～7.25（d，J= 7.5Hz，2H），7.08～7.06（d，J=7.5Hz，1H），6.74～6.72（d，J= 7.5Hz，2H），6.42（s，1H），6.39（m，1H），6.34～6.32（d，J= 16.8Hz，2H），3.40～3.29（q，J= 8.0Hz，8H），1.08～1.05（t，J= 8.0Hz，12H）。13C NMR（DMSO-d6，100MHz）（δ）： 163.84， 160.07， 153.15，151.58，149.71，148.83，133.99，129.61，129.10，128.13，125.98，124.20，123.29，116.13，108.38，106.14，97.73，65.82，44.10，12.88。元素分析[C31H34N4O3理论值/（实测值）]：C，72.92% （72.98%)；H，6.71%（6.67%）；N，10.97%（10.92%）。

1.4.2 PRAM的合成

在50mL三口烧瓶中，将0.255g（0.5mmol）Mrh、1.5g （21.13mmol） 丙 烯 酰 胺、0.10g （0.61mmol）偶氮二异丁腈溶解在30mL 环己酮中，于60℃、氮气保护环境中，反应7h。用丙酮沉析出聚合物。再用水、丙酮溶解、沉析3次，真空干燥，得粉红色固体，即探针PRAM，收率82%。FTIR（KBr）（v/cm-1)： 3300～3439 （ —NH， —NH2）、 2913（—CH2，—CH3）、1667（酰胺羰基）、1600、1470（苯环）。1H NMR（DMSO-d6，400MHz）（δ）：7.88（s，Ar-H），7.58～7.54（d，J=7.5Hz，Ar-H），6.89（d，J= 7.5Hz，Ar-H），6.75 （s，Ar-H），3.30（s， —NH）， 2.00～2.40 （m， —CH， —CH2），1.60～1.20（t，J= 8.0Hz，—CH3）。

2 结果与讨论

2.1 PRAM的合成与表征

探针PRAM经胺解、酰化、聚合三步反应得到，制备步骤少、合成条件简单、收率高。水溶性好的聚丙烯酰胺链的引入，增大了探针PRAM 的水溶性，为其实际应用，尤其是在生物活细胞荧光成像中的应用奠定了很好的基础。高分子探针PRAM的FTIR 谱上出现的特征峰：3300～3439cm-1（—NH、—NH2）、2913cm-1（—CH2、—CH3）、1667cm-1（酰胺羰基）、1600cm-1、1470cm-1（苯环），初步表明罗丹明B 与丙烯酰胺进行了共聚反应。对比探针PRAM 和单体Mrh 的核磁共振氢谱发现，聚合后，化学位移为6.32～6.40 的烯键质子峰消失，同时在化学位移为2.00～2.40附近出现了—CH—、—CH2—的质子峰，但依然可观察到氧杂萘环和罗丹明基团中苯环上的质子峰。这表明单体Mrh与丙烯酰胺进行了共聚反应，并且Mrh单元通过共价键连接在了高分子PRAM的侧链上。

2.2 探针PRAM的紫外-可见吸收光谱

在pH 4.0～9.0范围内测试探针PRAM的紫外-可见吸收光谱，见图3。结果显示，pH为7.0～9.0区间内，其吸光度变化不大，但在4.0～7.0区间内，其吸光度变化明显，且随pH变小（酸度增强），其吸光度大幅增强，并于526nm、567nm处出现两个吸收峰。因此可选取能量较高的526nm作为测试发射光谱的激发波长，567nm处的最大吸收峰应归属内酰胺螺环结构于酸性环境中开环所致，同时使溶液从无色向粉红色转变，表明探针PRAM 在4.0～7.0 的范围内可裸眼识别溶液pH的变化。

图3 PRAM在不同pH水溶液下的紫外-可见吸收光谱

2.3 探针PRAM的荧光光谱

选择526nm为激发波长，测定PRAM的荧光光谱，见图4。图4(a)显示，随着pH逐渐减小，探针PRAM于585nm处的荧光峰强度逐渐增强，发射出明亮的橙红色荧光。弱酸性（pH 为4.0～7.0）环境下，当pH等于4.0时，荧光强度升至最大，对比pH为9.0 时的荧光强度，其荧光强度提升了约10 倍。原因在于H+促进了螺内酰胺环开环，罗丹明内酰胺基团被质子化，同时形成了较大共轭体系，因此荧光强度大幅增强。同时当处于弱酸性环境，探针表现出较高的灵敏性。但在弱碱性（pH 为7.0～9.0）环境下，内酰胺基团去质子化，探针PRAM的存在形式为螺内酰胺环结构，故基本无荧光发射。此外，pH为5.0～6.0区间内，pH与585nm处的荧光强度具有良好的线性关系（见图4 插图）。其线性回归方程为：I=426.18-69.324c（式中，c为pH；I为585nm处的荧光强度），相关系数为0.9955。所以，在pH 为5.0～6.0 区间内，测得溶液中探针PRAM的荧光强度，可由此线性方程精确计算体系的pH。基于Henderson-Hasselbachtype方程[25]得式(1)。

图4 PRAM的荧光强度与pH的关系

式中，I代表585nm处的荧光强度。

由式(1)计算出探针PRAM 的pKa值为4.30。585nm 处，探针的荧光强度随pH 增大逐渐减弱，在pH为5.0～6.0区间内，变化最为显著[如图4(b)所示]，表明探针PRAM 适合用于弱酸性细胞器（如溶酶体、肿瘤细胞）pH变化的检测。

2.4 探针PRAM的选择性和抗干扰性

考虑到其他阳离子可能会干扰探针对pH 的准确检测，本文研究了探针PRAM的抗干扰性与选择性，结果如图5所示。图5(a)表明，当pH为5.0时，探针PRAM 产生明亮的橙红色荧光；但pH 为7.0时，对于空白样或金属离子会显示出较弱的荧光，可见对于H+，此探针表现出良好的选择性。图5(b)显示，处于弱酸性（pH为5.0）环境的各金属离子溶液相比于中性（pH为7.0）环境，其荧光发射明显增强，表明常见金属离子的存在，基本不影响对pH的检测效果，可见探针PRAM抗干扰性良好。

图5 探针PRAM的选择性和抗干扰性

2.5 探针PRAM的可逆性和重复使用性

大多数荧光探针与离子结合后结构稳定，常不具备检测可逆性，导致探针无法重复利用。为了使探针适应复杂的细胞环境，研究探针PRAM的可逆性对于实时监测细胞pH 变化有重要意义。因罗丹明内酰胺上氧原子可通过质子化、去质子化影响电子转移，可促进并诱导其开环与闭环，因此，理论上探针PRAM是可逆的，为了验证其可逆性，本实验研究了pH 分别为3.0 和7.0 时，探针PRAM 的可逆性，如图6所示。在pH=3.0时，探针PRAM荧光为“ON”态，发出强橙红色荧光；pH=7.0 时其荧光为“OFF”态，荧光几乎消失。在pH为3.0和7.0进行7次循环调节后，荧光强度衰减率仅为6.25%，可见探针PRAM在可逆性方面表现良好，可以重复循环使用。

图6 探针PRAM在585nm处的荧光强度在pH为3.0和7.0下的变化

2.6 生物细胞成像

研究了探针PRAM 在TM3 细胞中的荧光成像，结果如图7 所示。图7 表明，没有探针PRAM 加入和只有探针PRAM加入的TM3细胞中都无荧光呈现；然而，当pH=4.0 时，探针于TM3 细胞中发射出明亮的红色荧光；在pH=5.0 条件下，探针PRAM 在TM3细胞内可显示较暗的红色荧光；当pH提升至6.0或7.0 时，TM3 细胞中基本没有荧光。实验证实，探针PRAM容易进入细胞，透膜性优良，同时酸性环境下能够发射明亮的红色荧光，可实现对活细胞内pH 变化的荧光成像。因此，此实验结果对活细胞实时pH变化的可视化监测具有潜在应用前景。

图7 TM3细胞的荧光成像

3 结论

以罗丹明B、水合肼和丙烯酰胺等为原料，设计合成了一种含罗丹明内酰胺基团的高分子pH 荧光探针PRAM。其pKa值为4.30，在pH为3.0～7.0范围内，对H+有较好的选择性和灵敏度，可实时监测体系pH 变化。在pH 为5.0～6.0 范围内，其荧光强度与pH 具有良好的线性关系，可精确测定体系的pH。探针PRAM 在常见的金属离子存在下，仍具有良好的选择性和抗干扰性。同时还具备很好的可逆性和重复利用性。探针PRAM的水溶性、膜透性突出，弱酸性条件下可快速穿透细胞膜，并成功实现了TM3活细胞pH变化的荧光成像。因此，探针PRAM 可用于弱酸环境下的细胞器（如溶酶体、癌细胞等）内生理pH 变化的检测，对研究细胞生理功能和疾病诊断具有重要意义。