小檗碱调节HIF-1α/VEGF信号通路对皮肤溃疡大鼠血管生成和创面愈合的影响

齐淑静,付改霞,齐瑞霞

(河北工程大学附属医院,河北 邯郸056001)

皮肤溃疡是一种常见的外科多发病,具有病程迁延、易感染、易复发等特点,还存在致癌风险,炎症、血管生成等在皮肤溃疡创面愈合中发挥关键作用[1-2]。包括皮肤在内的各种组织溃疡创面愈合是一个多因素参与的复杂过程,炎症、血管生成与胶原合成等在其中发挥关键作用,抗炎处理及促血管生成是促进皮肤溃疡大鼠创面愈合的有效策略[3-4]。缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)/血管内皮生长因子(VEGF)信号可通过调控炎症、血管生成、成纤维细胞增殖、再上皮化等介导皮肤创面愈合过程[5]。增强HIF-1α表达可增强皮肤创面血管化,促进糖尿病足溃疡伤口愈合[6],还可升高VEGF表达,抑制炎症、促使血管生成,进而加快慢性皮肤溃疡创面愈合[7]。因此,上调HIF-1α/VEGF通路是促使皮肤溃疡创面愈合的有效手段。小檗碱(Berberine,BR)是许多中药含有的活性物质,具有消除氧自由基及炎症抑制作用,可通过减轻炎症、诱导血管形成等来加速糖尿病患者伤口愈合[8];能通过抗菌功效减轻皮肤伤口感染,并促使其创面愈合[9];且BR可通过激活HIF-1α信号保护肾小管上皮细胞免受缺氧和高糖诱导的凋亡[10]。因此,推测BR可能通过激活HIF-1α/VEGF信号通路来促进皮肤溃疡血管生成和创面愈合。本文制备皮肤溃疡模型大鼠,探究BR调节HIF-1α/VEGF信号通路对其血管生成和创面愈合的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠,SPF级,6～7周龄,体重230～260 g,购自广东莱迪生物医药研究院有限公司[生产许可证号SCXK(粤)2022-0064],将所有大鼠饲养在维持屏障环境的动物房内,饲养条件分别设定为:相对湿度55%～65%、温度23～25 ℃,并以明暗各12 h交替循环维持照明。

1.2 主要材料及试剂 100%冰醋酸购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;HIF-1α siRNA质粒及其对应空载质粒购自江苏谱新生物医药有限公司;水包油型乳膏基质购自广州市欧妍化妆品有限公司;HE染色试剂盒、BR(批号110713-201212)购自中国食品药品检定研究院;大鼠IL-8及IL-6酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒、兔SP免疫组化检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;偶联HRP的小鼠抗兔二抗、兔源抗大鼠anti-Collagen Ⅰ、anti-HIF-1α及anti-fibronectin抗体、兔源抗大鼠anti-GAPDH、anti-VEGF及anti-CD31抗体购买于英国Abcam公司等。

1.3 主要实验仪器 SP-Max2300A2自动酶标分析仪,购买自上海酶联生物科技有限公司;ARM-2216石蜡切片机,购买自湖北安立信医疗实业有限公司;NIB400倒置生物光学显微镜,购买自深圳市众寻光学仪器有限公司;SE400垂直蛋白电泳仪、TE62蛋白转印仪,购买自美国Amersham公司等。

1.4 研究方法

1.4.1 皮肤溃疡大鼠模型构建、分组及处理:参照文献[11]构建皮肤溃疡大鼠模型,取SD大鼠肌肉注射青霉素钾溶液,每只4000 U,1次/d,连续4 d后开始造模,以10%戊巴比妥钠溶液腹腔注射(3 ml/kg)麻醉,以8%硫化钠脱去大鼠背部毛发后于其背部制备一个1.5 cm×2 cm的缺损性皮肤创面,接着涂抹50%冰醋酸溶液,1次/d,连续7 d后即可形成皮肤溃疡模型,随机分为模型组(M组)、小檗碱低剂量组(BR-L组)、小檗碱高剂量组(BR-H组)、小檗碱高剂量+空载组(BR-H+pc-DNA组)、小檗碱高剂量+HIF-1α敲低组(BR-H+pc-HIF-1α KD组),每组10只,另选10只大鼠只进行脱毛操作作为对照组(C组)。制备BR乳膏:将乳膏基质加热至70 ℃左右时,取适量BR(批号110713-201212)药物粉末少量多次加入,缓慢搅拌混匀,静置至室温得到每100 g乳膏中含有60、120 mg BR的乳膏药物,BR-L组、BR-H组大鼠在其创面及附近皮肤组织处分别涂抹22、44 mg/cm2的BR乳膏(涂抹面积为5 cm2,1次/d)[12],同时分别在其创面创缘周围三点注射0.9%氯化钠溶液(剂量与BR-H+pc-HIF-1α KD组相同,2次/周);BR-H+pc-DNA组、BR-H+pc-HIF-1α KD组大鼠以同样方法涂抹44 mg/cm2的BR乳膏,同时分别在其创面创缘周围三点注射空载质粒、HIF-1α siRNA质粒(剂量按其说明书设定为50 μg/cm2,2次/周);C组(脱毛处对应的皮肤)和M组大鼠以同样方法分别涂抹与BR-H组相同量的乳膏基质,同时分别于其创面创缘周围三点注射0.9%氯化钠溶液(剂量与BR-H+pc-HIF-1α KD组相同,2次/周),每组大鼠均处理3周。

1.4.2 各组大鼠皮肤溃疡创面愈合率测定及标本采集:各组大鼠于3周处理结束后24 h麻醉,采集尾静脉血离心收集血清在-80 ℃保存;摄取各组大鼠创面图像后以Image J软件定量其创面面积,计算各组皮肤溃疡创面愈合率(皮肤溃疡创面愈合率=药物处理后皮肤溃疡创面面积/造模成功时皮肤溃疡创面面积×100%);颈椎脱臼处死各组大鼠,剥离皮肤溃疡处的创面组织,取约0.6 g保存在液氮中;剩余创面组织浸没在10%甲醛中固定,然后进行常规梯度脱水、透明处理,浸没在热石蜡中包埋,采用石蜡切片机做病理切片备用(C组大鼠取背部脱毛处皮肤组织)。

1.4.3 HE染色检测各组大鼠皮肤溃疡创面组织病理形态:取1.4.2中的各组大鼠皮肤溃疡创面组织切片,每只大鼠取3张经脱蜡、分级水化后以HE染色液孵育,参照HE染色试剂盒说明书中步骤行HE染色,洗片、脱水后封片观察,于光学显微镜中摄取各组皮肤溃疡创面组织病理形态图像。

1.4.4 免疫组织化学染色检测各组大鼠皮肤溃疡创面组织微血管密度(MVD):CD31阳性表达的血管内皮细胞可以标记微血管,取1.4.2中的各组大鼠皮肤溃疡创面组织切片经脱蜡、分级水化,以3%双氧水、孵育稀释200倍的CD31一抗(英国Abcam公司)溶液、洗片后参照兔SP免疫组化检测试剂盒说明书中步骤做免疫组织化学染色,漂洗后再次脱水、透明,进行封片后于光学显微镜中观察并拍摄各组创面组织图像,用Image J软件分析定量视野中切片面积及微血管数目,将单个CD31阳性血管内皮细胞或聚集呈细胞簇的CD31阳性血管内皮细胞设定为一个血管,采用以下公式算出MVD[MVD(个/mm2)=微血管数目/视野中切片面积]。

1.4.5 ELISA检测各组大鼠血清及皮肤溃疡创面组织炎性因子白细胞介素(IL)-6、IL-8表达水平:取出1.4.2保存在液氮中的皮肤溃疡创面组织,提取总蛋白后测其浓度,取1.4.2中血清4 ℃下解冻,每组取0.2 ml组织样品液及0.2 ml血清,采用ELISA试剂盒并按其说明书中方法分别测定其中IL-6、IL-8表达水平。

1.4.6 免疫印迹法检测各组大鼠皮肤溃疡创面组织HIF-1α/VEGF通路蛋白表达:取1.4.5中剩余的各组大鼠皮肤溃疡创面组织样品液,沸水浴加热变性其中蛋白后每组各取15 μg,120 V恒压下电泳分离后电转,所得膜浸入5%脱脂奶粉溶液封闭后剪下蛋白HIF-1α、VEGF、GAPDH的各组条带,采用相对应均稀释1000倍的一抗、稀释2000倍的二抗(英国Abcam公司)对上述各组蛋白做抗原抗体反应,然后通过化学发光法显色后摄取各组蛋白图像,最后用Image J软件定量其灰度值后量化其相对表达。

2 结 果

2.1 BR对各组大鼠创面愈合率的影响 与M组相比,BR-L组、BR-H组、BR-H+pc-DNA组大鼠创面愈合率均升高(均P<0.05),BR-H组、BR-H+pc-DNA组大鼠创面愈合率相比BR-L组进一步升高(均P<0.05);与BR-H组相比,BR-H+pc-HIF-1α KD组大鼠创面愈合率降低(P<0.05),BR-H+pc-DNA组大鼠创面愈合率无明显变化(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠创面愈合率比较(%)

2.2 BR对各组大鼠创面组织病理形态的影响 C组大鼠皮肤组织形态正常,肌纤维结构完好且排列整齐,血管形态正常;M组大鼠创面组织肌纤维断裂、排列杂乱,有明显炎性细胞浸润,并可见少量胶原纤维与毛细血管形成;与M组相比,BR-L组、BR-H组、BR-H+pc-DNA组大鼠创面组织肌纤维恢复较好,炎性细胞浸润减轻,同时胶原纤维与毛细血管形成增多;与BR-H组相比,BR-H+pc-HIF-1α KD组大鼠创面组织肌纤维损伤及炎性细胞浸润加重,同时胶原纤维与毛细血管形成减少;BR-H+pc-DNA组大鼠创面组织病理形态与BR-H组基本相似。见图1。

图1 HE染色检测各组大鼠创面组织病理形态(×200)

2.3 BR对各组大鼠创面组织MVD的影响 与C组相比,M组大鼠创面组织MVD升高(P<0.05);与M组相比,BR-L组、BR-H组、BR-H+pc-DNA组大鼠创面组织MVD均升高(均P<0.05),BR-H组、BR-H+pc-DNA组大鼠创面组织MVD相比BR-L组进一步升高(均P<0.05);与BR-H组相比,BR-H+pc-HIF-1α KD组大鼠创面组织MVD降低(P<0.05),BR-H+pc-DNA组大鼠创面组织MVD无明显变化(P>0.05)。见图2(表2)。

图2 免疫组织化学染色检测各组大鼠创面组织MVD(×200)

表2 各组大鼠创面组织MVD比较(个/mm2)

2.4 BR对各组大鼠血清及创面组织炎性因子水平的影响 与C组相比,M组大鼠血清及创面组织IL-6、IL-8水平升高(均P<0.05);与M组相比,BR-L组、BR-H组、BR-H+pc-DNA组大鼠血清及创面组织IL-6、IL-8水平均降低(均P<0.05),BR-H组、BR-H+pc-DNA组大鼠血清及创面组织IL-6、IL-8水平相比BR-L组进一步降低(均P<0.05);与BR-H组相比,BR-H+pc-HIF-1α KD组大鼠血清及创面组织IL-6、IL-8水平升高(均P<0.05),BR-H+pc-DNA组大鼠血清及创面组织IL-6、IL-8水平无明显变化(均P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清及创面组织炎性因子IL-6、IL-8表达水平比较

2.5 BR对各组大鼠创面组织HIF-1α/VEGF通路蛋白表达的影响 与C组相比,M组大鼠创面组织HIF-1α和VEGF蛋白表达稍有升高但差异无统计学意义(均P>0.05);与M组相比,BR-L组、BR-H组、BR-H+pc-DNA组大鼠创面组织HIF-1α和VEGF蛋白表达均升高(均P<0.05),BR-H组、BR-H+pc-DNA组大鼠创面组织HIF-1α和VEGF蛋白表达相比BR-L组进一步升高(均P<0.05);与BR-H组相比,BR-H+pc-HIF-1α KD组大鼠创面组织HIF-1α和VEGF蛋白表达降低(均P<0.05),BR-H+pc-DNA组大鼠创面组织HIF-1α和VEGF蛋白表达无明显变化(均P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠创面组织HIF-1α、VEGF蛋白表达水平比较

3 讨 论

皮肤溃疡长期不能愈合不仅给患者带来极大痛苦和负担,还会随病情反复而增加致癌风险,其临床治疗比较棘手,多以药物外用为主,但目前尚未有疗效特别突出的药物,目前亟须探寻开发更多、更有效安全的治疗药物[13-15]。本文采用制备创面后涂抹冰醋酸的方法建立皮肤溃疡模型,结果显示,模型大鼠皮肤溃疡创面组织肌纤维断裂、排列杂乱,有明显炎性细胞浸润,并可见少量胶原纤维与毛细血管形成,血清及皮肤溃疡创面组织炎性因子IL-6、IL-8水平升高,表明造模大鼠创面组织处于炎症状态,造模3周后还未愈合,提示模型构建成功。

BR是具有抗炎、抗感染等作用的一种季铵生物碱,广泛存在于中药材中,可用于治疗各种因素引发的溃疡,加速其创面愈合,BR可通过减轻氧化应激而抑制高糖诱导的人类永生化表皮细胞损伤凋亡,还可抑制炎症及促进血管形成、胶原沉积,从而加速糖尿病溃疡创面愈合[8-9,16],因此推测BR可以用于治疗皮肤溃疡。本文结果显示,相比M组,低剂量及高剂量BR组大鼠皮肤溃疡创面组织肌纤维恢复较好,炎性细胞浸润减轻,同时胶原纤维与毛细血管形成增多,皮肤溃疡创面愈合率、创面组织MVD升高,血清及皮肤溃疡创面组织IL-6、IL-8水平均降低,且高剂量BR作用更强,与文献[6-7,11]的研究结果相似。本文结果表明BR可降低炎性因子生成水平,进而阻止炎性因子诱发的炎性反应发生及进展,促进血管形成及胶原合成,加快皮肤溃疡创面愈合,剂量越高,功效越强,进一步证实了BR对各自原因引发的皮肤溃疡的治疗功效。

皮肤溃疡创面难以愈合与延长的炎症期、血管形成受阻有关,限制持续的炎症、减轻细菌感染、刺激肉芽组织血管生成和胶原沉积可有效促进创面愈合[17-18]。HIF-1α和VEGF是重要的血管形成因子,其表达受限可导致缺氧后新生血管受损,是造成糖尿病患者伤口愈合延迟的一个主要原因,增强其表达可起到抗氧化、抗炎和促进血管生成作用,并加快糖尿病损伤动物伤口创面愈合[19-20]。激活HIF-1α/VEGF信号还可通过增强血管及胶原生成、抑制炎症而促进慢性皮肤溃疡创面愈合[21-22]。本文结果显示,与M组大鼠相比C组大鼠皮肤溃疡创面组织HIF-1α、VEGF蛋白表达稍有升高,而以BR处理大鼠,可进一步升高皮肤溃疡创面组织HIF-1α、VEGF蛋白表达,表明HIF-1α/VEGF信号参与介导了皮肤溃疡大鼠血管生成和创面愈合过程,与文献[23-25]的研究结果相似;另外相比以前的研究,本文证实了HIF-1α/VEGF信号参与介导BR对皮肤溃疡大鼠血管生成和创面愈合的促进作用。本文结果显示以BR和HIF-1α siRNA联合处理皮肤溃疡模型大鼠,可减弱BR单独处理对炎性因子表达的降低作用,进而削弱BR的抗炎功效,拮抗其对血管形成及胶原合成的增强作用,最终逆转其对皮肤溃疡大鼠创面愈合的促进作用,提示BR促进皮肤溃疡大鼠血管生成和创面愈合是通过上调HIF-1α实现的。

综上所述,BR可上调HIF-1α及VEGF表达,从而降低炎性因子表达水平,增强皮肤溃疡大鼠血管生成与胶原合成,最终加快创面愈合,促使HIF-1α/VEGF信号途径传导可能是其药理机制之一。本文为BR治疗皮肤溃疡提供了新的理论依据,有利于其在皮肤溃疡临床治疗中的进一步开发应用。另外本文证实了BR可用于加快皮肤溃疡大鼠伤口愈合并对其药理机制进行了初步探讨,但关于BR调控HIF-1α/VEGF信号中VEGF分子及其下游信号分子的机制还未有涉及,存在一定不足,还需后续深入研究。