三结构域蛋白8、Ras相关蛋白35、多聚ADP核糖聚合酶1在子宫内膜癌组织中的表达及检测临床意义

左学骞,赵海波,李 丹

(沧州市人民医院妇科,河北 沧州 061000)

子宫内膜癌(Endometrial cancer,EC)是一种女性常见恶性肿瘤,好发于绝经期或绝经后妇女[1]。EC发病机制复杂多样,包括:原癌基因激活、血管新生等均与其有关,对相关因子表达进行检测有助于制定针对性治疗方案和生存改善。Rab蛋白是一种小GTP结合蛋白,拥有GTP酶活性,也被称为 Rab鸟嘌呤三核苷酸磷酸酶(Rab GTPase),于真核细胞与膜相关的细胞器中广泛存在,对细胞内膜运输功能有调节作用[2-4]。Ras相关蛋白35(Rab35)是Rab蛋白家族成员之一,以往研究中证实,Rab35蛋白参与胃癌、肺癌细胞的迁移侵袭过程[5]。三结构域蛋白8(Tripartite motif 8,TRIM8)属于TRIM蛋白家族的成员,能通过多种信号通路对炎症、肿瘤、免疫反应等进行调控,在脑胶质瘤、乳腺癌、肝癌及肾癌等中均有相关报道[6-7]。多聚ADP核糖聚合酶1(Poly ADP ribose polymerase-1,PARP-1)是一种有多功能的蛋白质翻译后修饰酶,能对组蛋白、RNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA连接酶和其自身等进行多聚ADP核糖基化的修饰,参与DNA复制和转录,维持基因组稳定、染色体结构完整及细胞凋亡过程,并在多种恶性肿瘤组织中有异常表达[8]。基于以上背景,本研究探讨TRIM8、Rab35、PARP-1与EC患者临床病理特征的关系,旨在为EC临床诊治研究提供新方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为2016年5月至2018年10月于本院收治的100例EC患者,年龄24～76岁,平均(55.43±8.75)岁;FIGO分期:Ⅰ期40例,Ⅱ期36例,Ⅲ-Ⅳ期24例;分化程度:高分化40例,中分化44例,低分化16例。取EC患者手术切除的癌旁组织(距癌组织>5 cm)和癌组织进行研究。病例纳入标准:经病理诊断为EC;初次手术且无术前放化疗史;本次试验内容患者与家属了解知情已签知情同意书。排除标准:伴有心、肝、肾、肺等疾病;合并其他肿瘤或肿瘤复发;自身免疫疾病;凝血功能障碍;语言障碍、精神疾病;手术禁忌证。本研究已获医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂和仪器 DAB显色试剂(上海源叶生物科技有限公司,货号R21317);免疫组化试剂盒(上海康朗生物科技有限公司,货号KL-D3026);光学显微镜(日本 Olympus公司)。

1.3 免疫组化检测组织中TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白表达 取EC组织和癌旁组织,经过脱蜡、脱苯、水化和抗原修复后,用3% H2O2去除内源性过氧化物酶,清洗并封闭10 min,分次加入TRIM8单克隆抗体、Rab35抗体、PARP-1抗体,4 ℃过夜,以PBS洗涤2 min,共3次,加入二抗,37 ℃ 20 min,以PBS洗涤2 min,共3次,加试剂SABC,37 ℃ 20 min,以PBS洗涤5 min,共4次,加入DAB显色剂,苏木精-复染、脱水干燥后封片,阴性对照以PBS代替,放于显微镜下观察染色强度及计算阳性细胞百分比。 TRIM8、Rab35、PARP-1阳性表现为淡黄色至棕褐色颗粒,光镜下随机选5个高倍视野,对阳性细胞数和细胞总数进行计数。阳性表达判定:阳性细胞所占百分比×染色强度,TRIM8蛋白表达<3分为阴性,≥3分为阳性[9];Rab35蛋白表达≤3分为阴性,>3分为阳性[10];PARP-1蛋白表达≥3为阳性,<3为阴性[11]。

1.4 临床资料收集 将患者临床资料,包括:年龄、临床分期、分化程度、浸润深度及淋巴结转移情况进行收集,分析子宫内膜癌组织TRIM8、Rab35、PARP-1表达与患者临床病理特征的关系。随访5年,以复诊、电话等方式,对患者死亡情况做记录。

2 结 果

2.1 子宫内膜癌组织和癌旁组织TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白表达比较 TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白阳性表达多为棕黄色,EC组织和癌旁组织中Rab35、PARP-1蛋白阳性表达率依次为71.00%(71/100)和35.00%(35/100)、74.00%(74/100)和43.00%(43/100),TRIM8蛋白阳性表达率分别为30.00%(30/100)和69.00%(69/100)(均P<0.01),见图1。

A:癌旁组织TRIM8表达;B:癌旁组织Rab35表达;C:癌旁组织PARP-1表达;D:EC组织TRIM8表达;E:EC组织Rab35表达;

2.2 TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白表达的相关性 Spearman相关性分析显示,EC组织中Rab35与PARP-1呈正相关,Rab35和PARP-1与TRIM8表达呈负相关(r=0.542、-0.461、-0.461,均P<0.05)。

2.3 TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白表达与患者临床病理参数的关系 EC组织TRIM8、PARP-1、Rab35蛋白阳性表达与年龄、分化程度、肌层浸润深度无相关性,同FIGO分期、淋巴结转移有关,Rab35蛋白阳性表达和肌层浸润深度有关(均P<0.05),见表1。

表1 TRIM8、Rab35、PARP-1蛋白表达与患者临床病理参数的关系[例(%)]

2.4 随访5年生存率 随访结果,Rab35阳性患者5年生存率55.17%(32/58)低于阴性患者70.57%(34/42),PARP-1阳性患者5年生存率65.96%(31/47)低于阴性患者79.24%(42/53),TRIM8阳性患者5年生存率93.33%(42/45)高于阴性患者72.73%(40/55)(均P<0.05)。

2.5 子宫内膜癌患者预后因素Cox回归模型分析 Cox回归模型分析发现,FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、肌层浸润深度≥1/2和PARP-1、TRIM8、Rab35表达异常为影响EC患者预后的危险因素(均P<0.05),见表2。

表2 子宫内膜癌患者预后因素Cox回归模型分析

3 讨 论

EC是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,多好发于中老年女性,临床中以阴道流血、异常排液及疼痛为主要常见表现,近年来,其发病率逐年增加,病死率也以每年1.4%的速度升高[12-13]。EC的进展与细胞因子、凋亡机制等关系密切[14]。凋亡信号失调能够使肿瘤细胞逃避外在的免疫监控和内在的细胞调节机制,促使组织发生癌变,因此,与凋亡失控调节相关的分子可能参与肿瘤的发生发展过程。

PARP-1与DNA修复和损伤诱导的凋亡密切相关,并能够维持基因组的完整性和稳定性[15-16]。Rab35蛋白则参与细胞的运输、释放、吞噬及迁移等过程[17-18]。TRIM8作为TRIM家族的重要成员之一,可激活p53信号通路,提高化疗药物的敏感性,增强抗肿瘤效用,又能通过激活NF-κB信号通路促进炎症相关肿瘤的进展[19-20]。例如:TRIM 8基因组位点在胶质母细胞瘤中出现杂合性丢失和频繁缺失,提高体内外的乳腺癌细胞增殖、迁移能力可通过敲除TRIM8实现,TRIM 8能通过恢复p53活性抑制肝细胞癌增殖等。在本研究中,癌旁组织TRIM8蛋白阳性表达率较子宫内膜癌组织阳性表达升高,子宫内膜癌组织Rab35、PARP-1蛋白阳性表达率高于癌旁组织,提示TRIM8表达降低,Rab35、PARP-1表达升高,可能与EC发生发展有关。进一步通过Spearman相关性分析发现,Rab35与PARP-1呈正相关,Rab35和PARP-1与TRIM8表达呈负相关,EC组织TRIM8、PARP-1、Rab35蛋白阳性表达与FIGO分期、淋巴结转移有关,除此之外,Rab35蛋白阳性表达也与肌层浸润深度有关。说明TRIM8在子宫内膜癌发生发展中可能发挥抑癌作用,Rab35、PARP-1发挥致癌作用,并能促进EC的发展、浸润和转移。PARP-1表达增强原因可能与肿瘤细胞增殖活跃后过氧化物大量产生有关,NO、氧自由基等产后使DNA损伤,导致DNA双链缺口和断裂,DNA损伤加重,出现过多DNA断端,使PARP-1活化[21-24]。在PARP-1活化的同时,其对DNA的修复能力下降,故当细胞处于低分化时,PARP-1表达升高。而何彩平等[23]发现,Rab35蛋白可消除抑制Akt磷酸化和P13K信号通路的活性蛋白,激活P13K/Akt通路并在体外使正常细胞发生癌变。武宸宇等[9]对于TRIM8表达与EC的关系进行研究,发现TRIM8的表达在转录后水平会受特定miRNA的调节,并认为miR-182-5p可能通过抑制TRIM8表达发挥致癌作用。

此外,本研究对EC患者进行5年随访,发现PARP-1阳性、Rab35阳性患者5年生存率低于阴性患者,TRIM8阳性患者5年生存率高于阴性患者,同时经过Cox回归模型分析发现,FIGO分期Ⅲ-Ⅳ期、肌层浸润深度≥1/2、PARP-1、TRIM8、Rab35是影响子宫内膜癌患者预后的独立因素。许高云等[25]收集72例EC患者临床资料并进行多因素Cox回归分析也发现,FIGO 分期、淋巴结转移、VEGF-C及Ki-67表达是影响EC患者预后状况的独立影响因素。这也与临床中癌灶浸润至深肌层或病理分期较高的EC患者易出现不良预后的结果是一致的,可见TRIM8、Rab35、PARP-1的表达水平监测能可为患者预后预测提供新思路,但具体作用机制还有待进一步研究证实。

综上所述,子宫内膜癌组织PARP-1、Rab35表达升高、TRIM8表达降低,PARP-1、TRIM8表达异常可能与子宫内膜癌的发生、发展和密切相关。