肿瘤坏死因子-α、可溶性血管内皮生长因子受体-1在妊娠期高血压疾病大鼠血清及胎盘中的表达水平及意义

王 艳,时玲玲,吴桂杰,李 霞,赵芳莹

(沧州市人民医院产科,河北 沧州 061000)

妊娠期高血压疾病(Hypertensive disorders complicating pregnancy,HDCP)是一种妊娠期特发病,诱发因素众多,病情复杂,临床表现以血压升高、蛋白尿及浮肿等表现为主,其病情也与新生儿不良结局发生有关,也是导致孕妇和胎儿死亡的主要原因之一[1-2]。正常妊娠是一种成功的自然半同种异体移植过程,有赖于母胎间免疫平衡,一旦免疫失衡就可能引起免疫排斥反应,导致病理妊娠[3]。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)是一种机体重要的促炎因子,由单核细胞、淋巴细胞及免疫激活的内皮细胞等分泌,正常妊娠时,TNF-α水平较低,若机体出现免疫紊乱或炎性反应时,TNF-α表达水平升高[4]。孕妇体内的炎症应答机制被激活后,易引起血管内皮功能障碍,可溶性血管内皮生长因子受体-1(soluble fms-like tyrosine kinase receptor 1,sFlt-1)是血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)受体之一,对于胎盘绒毛膜血管形成、滋养层细胞侵袭及分化和胚胎发育有调节作用,其异常表达与HDCP发病密切相关[5-6]。基于此,本研究探讨了TNF-α、sFlt-1在HDCP大鼠血清及胎盘中的表达,为进一步对HDCP的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性SD大鼠40只,雄性SD大鼠20只,SPF级,体重180～200 g,自西安交通大学实验动物中心购入,动物饲养条件:20～23 ℃,湿度60%～70%,明暗各12 h,自由饮水、摄食。

1.2 主要试剂和仪器 L-精氨酸甲酯(上海源叶生物科技有限公司,货号S20013);反转录试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司,货号D1801XL);BCA蛋白浓度测定试剂盒、PSB缓冲液(上海源叶生物科技有限公司,货号R21250、R22379);RIPA蛋白裂解液、总RNA提取、Trizol试剂(上海联迈生物工程有限公司,货号LM3201-1、LM-21087R、LM0016);苏木素-伊红染色(HE)试剂盒(上海抚生实业有限公司,货号FS-10-17869);实时荧光定量PCR仪、光学显微镜(日本 Olympus公司);电泳仪(美国 Bio-Rad公司);多功能凝胶成像系统(美国Syngene公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与模型制备:将雌性和雄性SD大鼠按照2∶1的比例合笼混养,于次日收集雌性大鼠阴道分泌物,用于镜下观察,当发现精子时则为妊娠第1天,选取20只雌性大鼠分为对照组和模型组,模型组大鼠于妊娠第14天起,每日皮下注射L-精氨酸甲酯125 mg/kg,1次/d,连续7 d,对照组大鼠给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃,妊娠21 d时,行血压及尿蛋白检测,若模型组孕鼠血压较对照组升高≥20 mmHg,尿蛋白≥(+)时,则表示造模成功。

1.3.2 孕鼠血压及24 h尿蛋白检测:分别于妊娠第14、21天测定大鼠血压,并将大鼠放入代谢笼中进行24 h尿液采集,测定尿液尿蛋白含量。

1.3.3 胎盘及血液标本采集:于妊娠第21天,将大鼠麻醉后采集腹主动脉血液标本,同时剖宫取出胎鼠,测定各组胎鼠身长、体重及胎盘重量,并分离胎盘组织,置入-80 ℃冰箱冷冻保存,用于后续实验。

1.3.4 血清TNF-α、sFlt-1水平测定:取各组大鼠血液标本,3000 r/min离心15 min后将上清收集,存于-80 ℃中,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清TNF-α、sFlt-1水平,试剂盒购自武汉益普生物科技有限公司(货号CSB-E11987r、MM-44222R1)。

1.3.5 HE染色:取各组大鼠胎盘组织,经脱水、透明、浸蜡、包埋及切片等步骤后,行HE染色再封片(中性树胶),放于光学显微镜下观察胎盘组织结构变化。

1.3.6 Tunel法检测胎盘组织细胞凋亡:取胎盘组织石蜡切片,先脱蜡和水化,再用PBS缓冲液冲洗2次,蛋白酶K处理15 min,2% H2O2处理5 min,经PBS冲洗2次,加Tunel反应液37 ℃避光30 min,每张切片随机取5个视野,荧光显微镜下观察,阳性细胞为棕色颗粒。

1.3.7 Western blot法检测各组大鼠胎盘组织中TNF-α、sFlt-1蛋白表达:取胎盘组织放入RIPA裂解液中,12000 r/min离心10 min后取上清液,BCA检测蛋白浓度,蛋白上样10 μg电泳,将电泳分离得到的样本,移到PVDF膜上固定,并封闭1 h(10%山羊血清),先一抗孵育过夜(4 ℃)后,加二抗(常温)孵育1 h,选β-actin为内参,经洗膜、显色后,成像拍照后做灰度值统计分析。

2 结 果

2.1 两组胎鼠发育情况比较 HDCP组胎鼠重量、胎盘重量、胎鼠身长均低于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05),见表1。

表1 两组胎鼠发育情况比较

2.2 两组大鼠血压及24 h尿蛋白含量比较 HDCP组大鼠妊娠21 d血压及尿蛋白含量高于妊娠14 d,HDCP组大鼠妊娠14、21 d血压及尿蛋白含量高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05),见表2。

表2 两组大鼠血压及24 h尿蛋白含量比较

2.3 两组大鼠胎盘组织结构比较 HE染色观察对照组大鼠胎盘组织形态和结构正常,细胞完整。HDCP组大鼠胎盘组织细胞结构不完整,绒毛数目减少,且绒毛大部分不成熟,滋养层细胞代偿性增殖。见图1。

图1 两组大鼠胎盘组织结构比较(HE染色,×400)

2.4 两组大鼠胎盘组织细胞凋亡情况比较 Tunel检测胎盘细胞凋亡,凋亡细胞显示棕色,对照组胎盘组织凋亡细胞较少,HDCP组胎盘组织中细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),见图2。

注：与对照组比较,*P<0.05

2.5 两组大鼠血清TNF-α、sFlt-1表达水平比较 HDCP组大鼠血清TNF-α、sFlt-1表达水平高于对照组(均P<0.05),见表3。

表3 两组大鼠血清TNF-α、sFlt-1表达水平比较(pg/ml)

2.6 两组大鼠胎盘组织中TNF-α、sFlt-1蛋白表达情况比较 HDCP组胎盘组织中TNF-α、sFlt-1蛋白表达水平高于对照组(均P<0.05),见图3。

注：与对照组比较,*P<0.05

3 讨 论

HDCP是指妊娠中晚期由于不明原因引起血压持续升高,该病发展急骤,可对孕妇多个器官造成损害,导致胎盘供血、供氧异常,影响胎儿生长发育,出现胎儿生长受限、早产等不良妊娠结局[7-8]。本研究通过皮下注射L-精氨酸甲酯建立HDCP模型,发现胎鼠重量、胎盘重量减轻,胎鼠身长小于对照组,HDCP大鼠妊娠21 d血压及尿蛋白含量高于妊娠14 d,HDCP大鼠妊娠14、21 d血压及尿蛋白含量高于对照组,且胎盘组织细胞结构不完整,绒毛数目减少,绒毛大部分不成熟,胎盘细胞凋亡率较高,提示HDCP大鼠蛋白尿、血压升高,胎盘受损,胎鼠发育异常,进一步表明造模成功[9]。

研究表明,正常妊娠期间细胞免疫以Th2型免疫为主。而发生HDCP则以Th1型免疫反应为主,即Th1/Th2关系失调,通过分泌IL-1、IL-2、TNF表现出免疫杀伤,并使内皮细胞结构、功能受损,影响胎盘组织血管发育和血供[10-12]。本研究对大鼠血清及胎盘组织TNF-α、sFlt-1表达水平进行检测,HDCP组大鼠血清及胎盘组织TNF-α、sFlt-1表达水平高于对照组,证实了血清及胎盘组织TNF-α、sFlt-1水平升高是HDCP发生的重要因素。其机制可能是TNF-α刺激了内皮细胞黏附分子表达[13]。正常情况下黏附分子表达很少,当受到TNF-α等细胞因子刺激时,血管内皮细胞功能出现紊乱,收缩血管物质和舒张血管物质分泌失衡,破坏血管调节功能,使滋养细胞侵入功能异常,螺旋小动脉生理重铸不能正常进行,引起了全身小动脉痉挛,出现外周阻力增加,出现血压升高、体液蛋白外渗等情况[14-17]。继而出现胎盘低灌注和缺氧,激活了sFlt-1基因的启动子区域中的低氧反应元件,使胎盘合成释放更多的sFlt-1,胎盘局部和血循环中的sFlt-1也随之增加,过度抑制由VEGF介导的血管生成作用,胎盘血管生长受阻,无法满足胎儿发育需求[18-21]。张凯歌等[22]发现,丹参川芎嗪注射液有扩张血管、改善血液微循环的效果,能降低血压及利尿,HDCP大鼠经丹参川芎嗪注射液干预后,胎盘sFlt-1表达水平降低,PLGF表达水平升高。熊智慧等[23]研究证实了,hucMSCsexo改善血管内皮功能是可通过上调VEGF表达,下降sFlt-1 的表达来发挥作用的。张蕊等[24]观察到妊娠高血压患者外周血可伴多种炎性因子异常表达,包括:IL-12、TNF-α,且两者与不良妊娠结局和病情严重程度有关。李玲等[25]给予妊娠高血压大鼠苦参碱及硫酸镁干预,发现能抑制大鼠胎盘组织中JAK2、STAT3磷酸化,减轻炎性反应(TNF-α、IL-6水平降低)及氧化应激,缓解内皮损伤。

综上所述,TNF-α、sFlt-1高表达可能与妊娠期高血压疾病发生密切相关,减轻炎性反应导致的内皮损伤,可能为临床HDCP的治疗提供帮助,但由于PDCH发病机制复杂,后续还需深入研究。