新疆一例牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体混合感染的病例初报

葛 婷，宋瑞其

（石河子大学医学院，新疆石河子 832003）

牛环形泰勒虫（Theileriaannulata）是一种由璃眼蜱属（Hyalommasp.）蜱虫传播的原生动物，可引起热带黄痿病[1]。患畜主要表现为发热、淋巴结肿大以及贫血等临床症状[2-3]。该病主要在地中海、中东地区流行，我国也存在该病，其发病率和病死率均较高，给畜牧业造成了严重经济损失[4-5]。念珠菌（假丝酵母，Candidatusmidichloriasp.）广泛存在于人类、动物和自然环境中，是常见的条件致病菌。通常因对易感动物长期使用抗菌药物，造成其黏膜屏障、免疫功能受损，从而感染念珠菌出现假丝酵母菌血症（又称为念珠菌菌血症）[6]。念珠菌不仅在动物血液中被发现，在蜱唾液腺中也被检测到[7]。无浆体是影响人类和动物健康的细胞内革兰氏阴性菌，其中绵羊无浆体（Anaplasma ovis）是主要种类之一[8]，在我国河北、贵州、浙江、新疆、甘肃、云南、河南、四川和青海等省（自治区）均有流行[8-15]。血液寄生虫/菌病是威胁牛健康和生产力的重要因素之一，尤其是在畜牧业发达的新疆地区。为对新疆托克逊县一头有症状牛进行病原确定，采用光学显微镜（LM）观察、常规血液检测（RBT）和聚合酶链式反应（PCR）等方法进行诊断，病牛最终被确诊为牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体混合感染。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例情况 2021年8月17日，新疆托克逊县一头4 岁的西门塔尔母牛表现出发热（39.7 ℃）、瘤胃胀气、肌肉震颤、流涎、血红蛋白尿（血尿）和黄疸等一系列症状。动物医院对患牛进行了临床和血常规检查，并在其体表发现正在叮咬的蜱虫。

1.1.2 试剂 组织/全血DNA 提取试剂盒，购自德国QIAGEN 公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18-T 载体，购自宝生物工程（大连）有限公司；大肠杆菌DH5α 感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司。其他常规试剂均为国产分析纯，所用水为超纯水。

1.2 样品采集

3 只蜱虫样品，采集自病牛体表。采集病牛耳尖静脉血液，直接制备薄血液涂片；使用颈静脉采血法，采集牛全血样品置于含有EDTA 的抗凝管中，以备后续血常规检测和DNA 提取用。

1.3 染色镜检

取10 μL 从耳尖静脉采集的血液制备薄血液涂片，然后按标准程序[16]对血液涂片进行吉姆萨染色。在双目显微镜（Nikon Eclipse E 200）油浸镜片下，对染色的血液涂片进行观察和拍照。

1.4 血常规检测

血常规是临床上最基础的化验检查之一。采用动物型血液分析仪测定采集的牛全血样品血常规17 项参数：白细胞（WBC）、淋巴细胞（LYM）、单核细胞（MONO）、中性粒细胞（NEU）、淋巴细胞百分比（LYM/%）、单核细胞百分比（MONO/%）、中性粒细胞百分比（NEU/%）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血红蛋白压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均血红蛋白含量（MCH）、平均血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度CV（RDWR）、红细胞分布宽度SD（RDWA）、血小板（PLT）、平均血小板体积（MPV）。

1.5 DNA 提取

取200 μL 抗凝牛全血样品，备用；取蜱虫3 只，以PBS 清洗3 次后经液氮研磨成粉状，置于1.5 mL EP 管中，加入200 μL PBS 溶解，备用。使用组织/全血DNA 提取试剂盒，分别对全血样品和蜱虫处理样品进行DNA 提取，并将提取的DNA 保存在-20 ℃冰箱备用。

1.6 PCR 检测

根据血涂片镜检结果，对牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体特定基因进行PCR 扩增（扩增体系及反应条件详见参考文献[17-20]）。牛环形泰勒虫扩增引物为18S-seq-F、18S-seq-R 和Tams 1-seq-F、Tams 1-seq-R；采用套式PCR 扩增念珠菌16S rRNA 基因，初始扩增引物为EC9 和EC12A，第二轮扩增引物为IS58-62f 和IS58-594r；绵羊无浆体PCR检测，选用裂殖子表面蛋白4基因（MSP4）为目的基因，扩增引物为MSP4-F 和MSP4-R。引物信息详见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列及目的条带大小

扩增的PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定无误后，以DNA 回收试剂盒进行回收；将回收产物分别连接至pMD18-T 载体，并转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞；挑取单菌落接种于含100 μg/mL 氨苄青霉素的LB 液体培养基，待菌液扩繁后收集500 μL 菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.7 系统进化树构建

根据获得的牛环形泰勒虫Tams1、念珠菌16S rRNA 和绵羊无浆体MSP4等基因序列，分别构建3 种病原的系统进化树。使用MEGA version 6.06软件构建进化树，采用相邻连接法，选择Tamura 3参数模型，伽马分布值设置为0.84，采用1 000 次引导重复计算、UPGMA 和节点支持的统计方法[21-22]。

2 结果

2.1 染色镜检

对染色的血液涂片进行镜检观察和拍照。结果（图1）显示，在显微镜下可见红细胞间存在大量呈卵圆形的芽孢和丝状的假菌丝，疑似念珠菌（图1-A 中黑色箭头）；红细胞内存在1 个或2 个较大的圆形/卵圆形病原，疑似牛环形泰勒虫（图1-B中红色箭头）；红细胞内有单个细小原点状病原，疑似绵羊无浆体（图1-B 中蓝色箭头）。

图1 血液涂片镜检结果（比例尺5 μm）

2.2 血常规检测

血常规检测结果（表2）显示，血红蛋白、血红细胞压积、平均血红蛋白浓度、中性粒细胞、血小板和淋巴细胞百分比等指标均有不同程度改变。结果提示，该牛机体存在贫血和炎症反应。

表2 血常规检测报告单

2.3 PCR 检测

使用前面所述的物种特异性引物，分别对所提取的血液、蜱虫DNA样品进行PCR检测。结果（图2）显示：对于血液样品，牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体PCR 检测均呈阳性；对于蜱虫样品，仅牛环形泰勒虫18S rRNA 基因PCR 检测为阳性，其他均为阴性。

图2 PCR 检测结果

2.4 系统进化树构建

2.4.1 牛环形泰勒虫 18S rRNA 和Tams1基因被认为是泰勒虫属/巴贝斯虫属鉴定和基因分型的潜在靶点。基于18S rRNA 基因的序列分析显示，新疆托克逊县牛环形泰勒虫株与相应土耳其株（宿主：盾陷璃眼蜱；GenBank sequence ID：MK918607）、中国株（宿主：瘤牛；GenBank sequence ID：MK415058）、伊拉克株（宿主：骆驼 科；GenBank sequence ID：MK855091）、 阿尔及利亚株（宿主：具环方头蜱/牛蜱；GenBank sequence ID：MH327776）和巴基斯坦株（宿主：牛；GenBank sequence ID：MG599091） 均具有100%的同源性，说明18S rRNA 基因过于保守，不适于构建进化树。基于Tams1基因的序列分析显示，新疆托克逊县牛环形泰勒虫株Tams1基因序列与我国河南株（GenBank sequence ID：KX904526）和突尼斯株（GenBank sequence ID：AF214905）同源性分别为99.25%和98.16%，与印度株（GenBank sequence ID：KT222946）和英国株（GenBank sequence ID：KX981032）同源性均为97.0%，与埃及株（GenBank sequence ID：AB917290） 和苏丹株（GenBank sequence ID：AF214831）同源性均为96.0%。结果表明，Tams1基因序列在牛泰勒虫属中呈现出多样性[23]，故可基于该基因进行系统发育分析。基于Tams1基因构建的进化树（图3）显示，本研究分离的牛环形泰勒虫株与河南株的遗传距离最近，其次是突尼斯株，而与苏丹株遗传距离最远（与同源性比对结果相一致）。因此，Tams1基因更适用于PCR 诊断牛环形泰勒虫感染。

图3 基于部分牛环形泰勒虫Tams 1 基因序列的系统进化树

2.4.2 念珠菌 同源性比对结果显示，本研究检出的念珠菌16S rRNA 基因序列与意大利菌株HM9（宿主：边缘璃眼蜱；GenBank sequence ID：LT898326）[24]关系最为相近（同源性96.26%），与澳大利亚菌株Ixholo2（宿主：全环硬蜱；GenBank sequence ID：FM992373）[25]和泰国菌株Hw191（宿主：微形血蜱；GenBank sequence ID：AF497582）[25]同源性较低，分别为95.23% 和93.52%。基于念珠菌16S rRNA 基因构建的进化树（图4）显示，本研究检出的念珠菌菌株自成一分支，推测这可能与地域和种间差异有关。

图4 基于部分念珠菌16S rRNA 基因序列的系统进化树

2.4.3 绵羊无浆体 同源性比对结果显示，病牛携带的绵羊无浆体MSP4基因序列与美国株（宿主：黑尾鹿；GenBank sequence ID：DQ320146）同源性为97.91%，与土耳其株（宿主：羊；GenBank sequence ID：KY283958） 和中国株（宿主：羊；GenBank sequence ID：HQ456349）同源性均为96.26%，与蒙古国株（宿主：山羊；GenBank sequence ID：LC4120088） 同源性为96.17%。基于MSP4基因序列构建的进化树（图5）显示：病牛携带的绵羊无浆体自成一分支，与美国株的遗传距离最近，与蒙古国株相距最远。

图5 基于部分绵羊无浆体MSP4 基因的系统进化树

3 讨论

本研究采用临床诊断、镜检、血常规检测、PCR 检测等方法，对新疆托克逊县患病牛进行了全面检查，最终确认病牛同时被牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体等3 种病原感染。

血涂片镜检结果显示，病牛疑似存在牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体混合感染。该牛表现为严重的瘤胃胀气症状，可能与感染血液寄生虫后瘤胃反刍迟缓有关[26]。血常规检测结果显示，血红蛋白压积低于正常值（仅22.9%），血小板值高达858×109/L，推测是因病原感染造成红细胞破裂和动物机能受损引起的[27]，从而导致患牛表现贫血、肌肉震颤和共济失调等症状[3]。另外，细菌和其他病原体可与血小板发生直接或间接的相互作用[27]，使宿主机体产生炎症反应[28]，从而呈现出血小板值偏高和平均血小板体积偏低等现象；白细胞和中性粒细胞偏低、淋巴细胞百分比偏高，则预示着感染可能造成了免疫系统功能下降[29]。

PCR 检测结果显示，在牛全血和体表蜱虫中均检出牛环形泰勒虫18S rRNA 基因阳性，表明患牛可能被携带牛环形泰勒虫的蜱虫叮咬而感染。但蜱虫样品中牛环形泰勒虫Tams1基因检测结果为阴性，推测可能由于Tams1是牛环形泰勒虫在红细胞内裂殖子期的表面抗原基因，故在蜱虫（牛环形泰勒虫子孢子期）样品中未被检测出。牛环形泰勒虫通过媒介蜱虫传播，这可能是该病在当地广泛流行的一个重要因素[30-31]。牛环形泰勒虫在我国主要分布于北方半干旱和荒漠草原，包括新疆、甘肃、宁夏、内蒙古、陕西、山西、黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、河南和湖北等地[30]。新疆牛环形泰勒虫感染率高达65%，导致的急性死亡率为30～50%[32]，特别在吐鲁番托克逊县，该病原非常流行。据报道[33]，2014—2016年托克逊县约49.46%（412/835）的无症状牛血检呈牛环形泰勒虫阳性。在托克逊县，蜱虫是牛环形泰勒虫的主要传播媒介[34]，但并未在其体内检测出念珠菌属和绵羊无浆体等病原。然而，在意大利北部[35]、尼日利亚[36]、加拿大哈巴罗夫斯克[37]、俄罗斯[38]和伊朗[39]等国家（地区）媒介硬蜱上曾发现念珠菌。另外，绵羊无浆体是反刍动物蜱传热的病原体，可由草原革蜱、森林革蜱、边缘革蜱[40]和银盾革蜱[41]等传播。该病在新疆阿克苏、喀什[42-43]、昌吉和呼图壁[44]等地区均有报道，因此不排除托克逊县媒介蜱虫未携带、传播这些病原，这有待进一步研究证实。

进化树分析结果表明，3 种病原在不同地区、不同宿主间存在基因差异，这可能由于地理隔离、遗传分化等因素造成。目前，牛环形泰勒虫、念珠菌和绵羊无浆体混合感染牛只的病例尚未见报道，然而这些疾病存在对牛产业发展造成经济损失等潜在风险。蜱虫在疾病传播中起到了关键作用，因此要加强对蜱虫的防控以及提升病原检测能力，从而促进新疆牛产业健康发展，提高边疆地区牧民生活水平。