新疆南疆部分奶牛场的支原体分离鉴定及耐药基因检测

冷 婧，温国平，张雪丽，王宏图，胡建军，张 伟

（1.塔里木大学兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆阿拉尔 843300；2.阿克苏地区沙雅中等职业技术学校，新疆沙雅 842200；3.塔里木大学生命科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300；4.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300；5.阿克苏市西域牧业发展有限公司，新疆阿克苏 843000）

支原体种类繁多，在自然界中广泛存在，能感染牛且有致病性的支原体主要有牛支原体（Mycoplasmabovis，M.bovis）、 牛鼻支原体（Mycoplasmabovirhinis，M.bovirhinis）、殊异支原体（Mycoplasmadispar，M.dispar）和精氨酸支原体（Mycoplasmaarginini，M.arginini）。1983年，我国首次成功分离到6 株牛支原体[1-2]。支原体可通过飞沫或接触传播，感染牛后可引发呼吸系统综合征、结膜炎、中耳炎、乳腺炎、关节炎等疾病[3-8]，严重时能导致患畜死亡，通常在规模化养殖场呈季节性流行。随着抗生素的广泛应用，支原体耐药性逐渐增强，部分菌株呈多重耐药，而目前市面上可用于支原体病治疗的抗生素较少，严重影响临床治疗效果[9～11]。

图1 鼻拭子支原体16S rRNA 基因PCR 鉴定结果

为进一步掌握新疆南疆地区集约化奶牛场支原体的分子特征及耐药现状，采集8 个集约化奶牛场犊牛鼻拭子样品进行了支原体分离纯化、分子生物学鉴定、形态学鉴定、生化鉴定及耐药基因检测，以期为该地区牛支原体病防控提供数据支撑，为指导该地临床用药，研发牛支原体病疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2021年12月—2022年3月，采集新疆南疆地区8 个集约化奶牛场有咳喘、流鼻涕等呼吸道症状的1月龄犊牛鼻拭子样本41 份，置于-80 ℃保存。样品信息见表1。

表1 样品信息表

1.1.2 主要试剂与仪器 PPLO 肉汤、支原体肉汤、琼脂，购于生工生物工程有限公司；生化鉴定管、药敏试纸，购于青岛海博生物技术有限公司；DL 2 000 DNA Marker、2 ×TaqPCR Master Mix、DNA 凝胶回收试剂盒、TIAN gel Midi Purification Kit，购于天根生化科技有限公司；丙酮酸钠、氨苄青霉素钠，购于北京索莱宝科技有限公司。PCR仪，购于TECHNE 公司；电泳仪，购于Thermo Fisher 公司；凝集成像仪，购于Bio-RAD 公司。

1.1.3 引物合成 参照文献[12-13]合成支原体16S rRNA 通用引物，送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物信息见表2。

表2 引物信息表

1.2 方法

1.2.1 菌株分离 将鼻拭子样本经0.22 μm 滤器过滤后，加入PPLO 肉汤/支原体肉汤中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养3～5 d；待培养基由橙红色变为黄色时，进行传代培养，按1:10 比例传代3 次；将培养液按10-1～10-3稀释，分别取100 μL 涂布于PPLO 琼脂/支原体琼脂上，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养4～6 d。

1.2.2 菌株DNA 提取 取2 mL 液体培养物，经13 000 r/min 离心30 min 后弃上清液；用0.1 mol/L PBS 缓冲液冲洗沉淀3 次后，加入50 μL PBS 缓冲液煮沸10 min，立即冰浴15 min；5 000 r/min 离心5 min 后取上清液，即为DNA 模板，置于-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR 鉴定 PCR 反应体系：2×TaqMaster Mix 8.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板3.0 μL，ddH2O 8.0 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。将反应产物送至上海派森诺生物公司测序，将获得的序列进行BLAST 比对，使用DNAstar 进行遗传进化树构建。

1.2.4 形态学鉴定

1.2.4.1 镜检 在固体培养基上纯化培养4～6 d后，在显微镜下观察形态。

1.2.4.2 Dienes 染色 在培养分离株的固体培养基表面滴加10 倍稀释的Dienes 染液，1～2 min 后弃掉染液，用PBS 或生理盐水冲洗2 次，3 min/次，吸尽液体。

1.2.5 生化鉴定 按试剂说明书分别对分离株进行葡萄糖发酵试验、甘露醇分解试验、精氨酸水解试验和明胶液化实验。

1.2.6 耐药基因检测 参照文献[14～17]合成6类19 种耐药基因的特异性引物进行检测。引物信息见表3。

表3 耐药基因引物序列

2 结果

2.1 PCR 鉴定

用支原体16S rRNA 通用引物检测41 份鼻拭子样品。结果（图1）显示，有16 份鼻拭子样品检出1 021bp 目的片段。

对16 份支原体阳性牛鼻拭子样品进行核苷酸序列同源性比对。结果（表4）显示：共检出4 种支原体，分别为牛支原体43.75%（7/16）、牛鼻支原体18.75%（3/16）、殊异支原体18.75%（3/16）和精氨酸支原体18.75%（3/16）。8 个集约化奶牛场的支原体个体阳性率为25.00%～60.00%，场群阳性率为100%（8/8）。4 种支原体在阿克苏地区均有检出，最常检出的是牛支原体单感染，其次为殊异支原体+牛鼻支原体混合感染。

表4 8 个养殖场牛支原体PCR 检测结果

将其中8 个阳性鼻拭子样本序列分别命名为牛支原体NZ1、NZ2，殊异支原体SY1、SY2，牛鼻支原体NB1、NB2，精氨酸支原体JAS1、JAS2。使用DNAstar 进行遗传进化树构建。结果（图2）显示：NZ1 与匈牙利流行株（登录号KX462371）同源性达92.4%，NZ2 与美国流行株（登录号NR_102850）、瑞典流行株（登录号U02968）同源性高达100%；SY1、SY2 与英国流行株（登录号NR_025182）同源性达99.3%～99.5%；NB1与美国流行株（登录号NR_025986）、日本流行株（登录号LC158834）同源性达94.3～97.6%，NB2 与土耳其流行株（登录号MK789478）同源性达100%；JAS1、JAS2 与美国流行株（登录号U15794、HQ661819）、日本流行株（登录号LC158832）、土耳其流行株（登录号MK789485）的同源性达99.5%～99.9%。

图2 支原体16S rRNA 序列系统遗传进化树

2.2 形态学鉴定

2.2.1 镜检 通过分离培养，共获得6 株支原体，其中牛支原体4 株、殊异支原体2 株。在体视显微镜下观察，可看到具有中心脐的“煎蛋样”菌落，与典型支原体菌落形态一致（图3～4）。

图3 牛支原体菌落形态

图4 殊异支原体菌落形态

2.2.2 Dienes 染色 分别取1 株牛支原体和殊异支原体进行Dienes 染色。结果（图5～6）显示，菌落呈中心深蓝色，边缘浅蓝色的透明圈。

图5 牛支原体Dienes 染色形态（60×）

图6 殊异支原体Dienes 染色形态（40×）

2.3 生化鉴定

对2 种支原体分离株分别进行生化试验，结果分别符合牛支原体和殊异支原体的生化特性（表5）。

表5 生化鉴定结果

2.4 耐药基因检测

对6 株支原体分离株进行6 类19 种耐药基因检测。结果显示，牛支原体的TEM、tetC、gyrA基因检出率均为100%，parC检出率为75%（阿克苏地区C 场未检出），其余15 种耐药基因均未被检测到；殊异支原体的TEM、tetC、gyrA、parC基因检出率均为100%，其余15 种耐药基因均未被检测到。

3 讨论

支原体感染难以治愈，是引发牛呼吸系统疾病的重要病原之一。我国目前关于牛支原体的研究相对较多，但关于牛鼻支原体、殊异支原体、精氨酸支原体的报道仍十分少见。2018年马艳君等[18]研究发现，四川省部分地区存在牛支原体、殊异支原体和牛鼻支原体感染。本试验通过分析阳性样本序列证实，新疆南疆地区集约化奶牛场均存在牛支原体、牛鼻支原体、殊异支原体和精氨酸支原体感染，检出率分别为43.75%、18.75%、18.75%和18.75%，其中检出频次最高的支原体组合是殊异支原体与牛鼻支原体，其次是殊异支原体和牛支原体，而3 种或4 种支原体同时存在于一个场的检出率为0；遗传进化树分析结果显示，4 类支原体与国外多个流行株同源性为92.4%～100%。以上结果说明，新疆南疆地区存在多种支原体流行，其感染组合模式也与国外研究[19-21]相似，极有可能是由境外输入我国的，这提示相关部门应当加强引进检疫工作，防控输入型流行株感染。

因未设置支原体药敏试验对照菌株，故本研究进行了耐药基因检测。结果显示：牛支原体分离株检测到4 种耐药基因，头孢菌素类TEM、喹诺酮类gyrA、四环素类tetC的检出率均为100%，喹诺酮类parC基因的检出率为75.0%，其余15 种耐药基因均未被检测到；殊异支原体分离株也检测到4 种耐药基因，头孢菌素类TEM，喹诺酮类gyrA、parC和四环素类tetC 检出率均为100%，其余15 种耐药基因均未被检测到；分离菌株含3 种、4 种耐药基因的占比分别为16.67%、83.33%，与孟凡艳[22]等在新疆石河子地区进行的药敏试验结果相似。

新疆南疆地区存在多种支原体流行，其耐药情况不容乐观，给该地区支原体病防控与治疗带来极大困难，应引起足够重视。