格列齐特灌胃对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障功能的影响及机制

练强

成都市第三人民医院药学部，成都610000

溃疡性结肠炎（UC）是一种复发和缓解反复变化的炎症性肠病，表现为疲劳、腹痛、血性腹泻和大便失禁，其病因涉及环境、免疫系统、肠道微生物群和疾病遗传易感性之间的相互作用［1］。研究表明，UC 的发生发展与肠黏膜屏障功能的改变密切相关［2］。晚期糖基化终末产物（AGE）通过糖化蛋白质或脂质与糖结合产生，是人类多种疾病发生的主要病理因素。AGE 受体（RAGE）是AGE 促炎反应的主要受体，且大多数RAGE 激活剂可导致下游炎症级联反应的发生，但该通路是否参与UC 的发展尚不明确［3-4］。格列齐特（GLZ）是第二代磺脲类药物，属于一种抗糖尿病药物，可直接刺激β 细胞分泌胰岛素，但研究证明磺脲类药物同时具有抗炎作用［5］。有学者报道，GLZ 通过抑制结肠炎症治疗UC［6］，但相关的机制研究极少。2022 年3 月—2023 年1 月，我们就GLZ 调节AGE/RAGE 信号通路对UC 大鼠肠黏膜屏障功能的影响进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 8 周龄SD 大鼠54 只，体质量180～220 g，济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）2019-0003；三硝基苯磺酸（TNBS），美国Sigma 公司提供；GLZ，上海宝曼生物科技有限公司提供；D-乳酸（D-LA）试剂盒，上海酶联生物科技有限公司提供；二胺氧化酶（DAO）试剂盒，Elabscience公司提供；苏木素伊红染色试剂盒，索宝莱科技有限公司提供；RAGE 过表达慢病毒载体及慢病毒空载体，Genechem 公司提供；RAGE、磷酸化核转录因子κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB p65 一抗，abcam 公司提供；AGE 抗体，Santa Cruze 公司提供；电转系统及电泳仪、转膜仪，Biorad 公司提供；酶标仪（Tecan infinite M200 型），瑞士Tecan 公司提供；光学显微镜（BX43型），日本OLYMPUS公司提供。

1.2 UC大鼠模型制备、分组及干预 将大鼠饲养于标准条件的鼠笼里，温度20～26 ℃，光照、黑暗时间各为12 h，相对湿度40%～70%，按照标准实验室方法进行喂食喂水，实验严格按照伦理委员会批准的相关伦理标准和规定进行。大鼠适应性喂养7 d后，随机分为造模组（42只）和空白组（12只）。造模组按照文献造模方法［7］采用TNBS、乙醇灌肠方法建立UC大鼠模型。空白组采取相同的方法以生理盐水灌肠。于造模第2天同一时间从造模组、空白组各随机选取2只大鼠制作结肠组织病理切片，观察溃疡形成情况，验证UC大鼠造模成功，并将造模组剩余40只大鼠随机分为UC组、GLZ组、GLZ+空载体组、GLZ+RAGE过表达组。剩余10只空白组及UC 组大鼠以生理盐水灌胃干预，GLZ 组大鼠以10 mg/kg 格列齐特灌胃干预，GLZ+空载体组大鼠在GLZ组的基础上进行尾部注射0.15 μL慢病毒空载体干预，GLZ+RAGE过表达组大鼠在GLZ 组的基础上进行尾部注射0.15 μL RAGE过表达慢病毒载体干预。以上各组每日干预1次，连续干预14 d。干预结束后，观察各组大鼠一般情况及精神状况，并记录大鼠体质量变化。

1.3 各组大鼠疾病活动指数（DAI）评分 以粪便性状、粪便血及体质量对大鼠进行DAI 评分。粪便正常计为0 分，粪便成型且为软便计为2 分，粪便不成型且为软便计为3分，腹泻计为4分。大鼠体质量下降率小于1%计为0 分，体质量下降率1%～5%计为1 分，下降率＞5%～10%计为2 分，下降率＞10%～15%计为3分，下降率＞15%计为4分；粪便潜血试剂盒检测（-）计0 分，（+）计1 分，（++）计2 分，（+++）计3 分，（++++）计4 分。DAI 评分为（粪便性状评分+体质量下降率评分+粪便血评分）/3。

1.4 血清DAO、D-LA水平检测 麻醉各组大鼠，腹部主动脉取血1 mL，3 500 r/min离心10 min，取上清液，采用ELISA 法严格按照试剂盒说明书检测血清DAO、D-LA水平。

1.5 结肠组织病理学变化及评分变化检测 取各组大鼠适量结肠组织以4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切成3 μm 厚切片。经洗涤、水化后用苏木精伊红染色，于镜下观察结肠组织损伤情况并参照文献［8］进行组织病理评分。

1.6 结肠组织髓过氧化物酶（MPO）活性检测 取适量结肠组织，用磷酸缓冲液在冰上匀浆，匀浆液超声粉碎10 s 后反复冻融3 次，4 ℃ 5 000 r/min 离心20 min，离心后取组织上清液加入0.1%过氧化氢的磷酸钠缓冲溶液、0.000 5%邻联二茴香胺，在460 nm处进行2 min的扫描，以第30秒至第90秒的1 min内光密度变化代表酶活性改变，25 ℃条件下1 min 降解1 μmol的过氧化氢记作MPO活性为1 U。

1.7 结肠组织RAGE、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达检测 取适量结肠组织，RIPA裂解提取总蛋白，通过SDS-PAGE 分离蛋白质并转移至PVDF 膜上。将PVDF 膜在室温下用10%脱脂牛奶中封闭1 h，并加入RAGE、p-NF-κB p65、NF-κB p65 一抗的抗体在4 ℃条件下过夜孵育，洗涤后在37 ℃下加入二抗孵育2 h，PBS 充分洗涤。以β-actin 为内参，采用Image J 软件进行p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白半定量分析，并计算p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值。

1.8 结肠组织中AGE 蛋白表达测定 制备结肠组织切片，常规脱蜡水洗后进行抗原修复，PBS 冲洗，加入1∶100 稀释的AGE 一抗4 ℃条件下过夜孵育，在37 ℃下加入二抗孵育30 min。PBS洗涤后经二氨基联苯胺显色，水洗后苏木素复染，经梯度乙醇脱水后封片，于镜下观察AGE 蛋白表达情况，以积分光密度值计算AGE蛋白表达。

1.9 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料符合正态分布以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状况及DAI 评分 空白组大鼠精神状态良好，大便正常；UC组大鼠精神状态较差，大便量增加且带浓血，出现拱背、活动量减少等症状，体质量降低。与UC 组相比，GLZ 组、GLZ+空载体组大鼠精神状态明显改善，大便量减少，未见黏液脓血，体质量增加；与GLZ+空载体组相比，GLZ+RAGE 过表达组大鼠精神状态变差，黏液脓血依然存在，体质量降低。空白组、UC 组、GLZ 组、GLZ+空载体组、GLZ+RAGE 过表达组DAI 评分分别为（0.00 ± 0.00）、（3.02 ± 0.31）、（2.04 ± 0.21）、（2.09 ± 0.21）、（2.93 ± 0.30）分。UC 组与空白组比较，GLZ 组、GLZ+空载体组与UC 组比较，GLZ+RAGE 过表达组与GLZ+空载体组比较，DAI 评分差异有统计学意义（P均＜0.05）。

2.2 各组大鼠血清DAO、D-LA 水平比较 各组大鼠血清DAO、D-LA水平比较见表1。

表1 各组大鼠血清DAO、D-LA水平比较（± s）

表1 各组大鼠血清DAO、D-LA水平比较（± s）

注：与空白组相比，aP＜0.05；与UC 组相比，bP＜0.05；与GLZ+空载体组相比，cP＜0.05。

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2.3 各组大鼠结肠组织病理学变化 空白组大鼠结肠黏膜外观正常，上皮完整，大鼠结肠组织结构清晰，未见明显病变。UC 组有水肿、充血、溃疡现象，结肠组织与黏膜、肠道粘连；黏膜处有多处溃疡形成，存在中性粒细胞、淋巴细胞浸润。经GLZ 干预后，结肠组织粘连减轻，炎性浸润降低；GLZ+RAGE过表达组依然可见有水肿、充血、溃疡现象，炎性浸润及肠道粘连明显。空白组、UC 组、GLZ 组、GLZ+空载体组、GLZ+RAGE 过表达组大鼠结肠病理学评分分别为（2.57 ± 0.26）、（12.33 ± 1.24）、（5.34 ±0.54）、（5.45 ± 0.54）、（11.08 ± 1.11）分。UC 组与空白组比较，GLZ 组、GLZ+空载体组与UC 组比较，GLZ+RAGE 过表达组与GLZ+空载体组比较，结肠组织病理评分差异有统计学意义（P均＜0.05）。

2.4 各组大鼠结肠组织MPO 活性变化 空白组、UC 组、GLZ 组、GLZ+空载体组、GLZ+RAGE 过表达组大鼠结肠组织MPO 活性分别为（0.10 ± 0.01）、（2.47 ± 0.25）、（1.22 ± 0.13）、（1.25 ± 0.13）、（2.28 ± 0.23）U/mg。UC 组与空白组比较，GLZ 组、GLZ+空载体组与UC 组比较，GLZ+RAGE 过表达组与GLZ+空载体组比较，结肠组织MPO 活性差异有统计学意义（P均＜0.05）。

2.5 各组大鼠结肠组织AGE/RAGE 信号通路相关蛋白表达 各组大鼠结肠组织AGE、RAGE、p-NFκB p65、NF-κB p65 蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65见表2。

表2 各组大鼠结肠组织AGE/RAGE信号通路相关蛋白表达比较（xˉ± s）

3 讨论

UC 是一种主要影响直肠和结肠的慢性非特异性肠道炎症性疾病，治愈率低，复发率高，也是肠道肿瘤发生的危险因素［9］。目前临床上使用氨基水杨酸、免疫抑制剂、糖皮质激素治疗UC，但治疗效果不佳［10］。因此，进一步探讨UC的病因和发病机制以便研发新的有效治疗药物成为近年来临床研究热点。

GLZ 为第二代磺脲类抗糖尿病药物，对1 型糖尿病和2 型糖尿病都有理想效果［11］。潘文强等［12］研究发现，在糖尿病大鼠模型中，GLZ可以抑制细胞凋亡，降低氧化应激成熟进而发挥保护大鼠心肌组织的作用。MAFRA 等［13］研究证明，GLZ可明显改善口腔溃疡症状，加快黏膜恢复，表现出较好的抗氧化、抗炎作用。牙周病模型研究显示，GLZ 可降低巨噬细胞、中性粒细胞的迁移，减少炎症反应，防止骨丢失［14］。ARAFA 等［6］研究发现，GLZ 可通过降低靶器官结肠的炎症反应减轻UC 病理损伤。本研究发现，UC 组大鼠结肠组织存在严重病理损伤，体质量降低，DAI及结肠组织病理评分增大，结肠组织MPO活性、DAO、D-LA 水平升高。但经GLZ干预后，大鼠形态组织变化及病理损伤程度改善，体质量显著增加，DAI 及结肠组织病理评分减小，结肠组织MPO活性、DAO、D-LA 水平明显降低，提示GLZ可以改善UC 大鼠病理损伤症状，抑制炎性浸润，保护肠黏膜屏障功能。

AGE及其细胞受体RAGE与多种疾病的病情发展相关。AGE 的升高会促进活性氧的产生，进而通过RAGE 触发氧化应激，导致NF-κB 易位激活，进而激活许多细胞因子的促炎基因，促进炎症发生［15］。NF-κB p65 是NF-κB 家族的一个亚基，其存在可以激活NF-κB通路，导致其转录活性上升，进而调控细胞内多个信号通路和炎症反应。p-NF-κB p65 是NF-κB p65 的一种磷酸化修饰形式，也是NF-κB p65的活化形式，主要定位在细胞核，磷酸化状态可以影响NF-κB p65 的转录活性。相对于p-NF-κB p65 或NF-κB p65 单独变化，p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值变化可以更加清晰显示NF-κB p65 在UC 大鼠体内的状态，反映NF-κB p65 由质入核的情况。在d-核糖引起的小鼠肾脏损伤及肾小球系膜细胞研究中，d-核糖以RAGE 依赖的方式诱导NF-κB 产生炎症反应，被认为是肾病发生的触发机制［16］。在糖尿病周围神经病变大鼠模型研究中，肌苷可通过降低RAGE 表达和p-NF-κB p65/NF-κB p65 值阻断AGEs/RAGE 信号通路，发挥降血糖、抑制氧化应激作用，以减轻糖尿病周围神经病变［17］。本研究发现，UC 组大鼠结肠组织中AGE、RAGE 蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均升高，说明AGEs/RAGE信号通路和NF-κB p65处于活化状态，结肠损伤诱导NF-κB p65 磷酸化，改变NF-κB p65 的定位，由细胞质迅速转入细胞核内，启动细胞核转录，进而促进炎症反应的发生，提示RAGE过表达参与UC的发展过程。经GLZ 干预后，大鼠结肠组织中AGE、RAGE 蛋白表达及p-NF-κB p65/NF-κB p65 值均降低。提示GLZ 可能通过抑制AGEs/RAGE 通路发挥保护肠黏膜屏障功能的作用。为验证此研究结果，本研究设立GLZ+RAGE 过表达组，发现RAGE 过表达可逆转GLZ 对UC 大鼠结肠组织的保护作用，进一步表明GLZ 减轻肠道炎症反应、促进结肠黏膜愈合可能与抑制AGEs/RAGE通路有关。

综上所述，GLZ 可通过阻断AGEs/RAGE 信号通路，减轻NF-κB p65 激活引发的炎症反应，保护肠黏膜屏障功能，有可能成为未来临床治疗UC 的新型药物。