两段式腌制过程中三穗咸蛋黄挥发性风味物质的变化研究

包欢欢,王修俊,*,于沛,何春霞,李佳敏,许九红, 冯廷萃,吴拥军

1(贵州大学 酿酒与食品工程学院,贵州 贵阳,550025)2(贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州 贵阳,550025) 3(贵州大学 辣椒产业技术研究院,贵州 贵阳,550025)4(镇远县名城食品厂,贵州 镇远,557700)

三穗鸭蛋具有营养丰富的特点,其制成咸鸭蛋后具有松沙出油和口感鲜香的特点[1-2]。蛋黄是三穗咸鸭蛋的品质体现与价值所在,因此常被应用于月饼和粽子等食品的馅料中[3-4]。目前,三穗咸鸭蛋的腌制方式主要有盐水浸泡法和盐泥涂抹法[5-6],但这2种方式的产品都存在蛋清盐含量高的问题,从而导致口感过咸。为解决这个问题,本研究团队利用两段式盐水浸泡法,将蛋清盐含量控制在3.65%左右,且蛋黄出油量保持在68.82%左右,在保证咸蛋品质良好的同时改善了口感[7]。

三穗鸭蛋黄和市售鸭蛋相似,其腥味较鸡蛋更重,不适于鲜食。盐水的腌制,能在一定程度上降低三穗鸭蛋黄的腥味,同时给予其特殊的香味[8]。腌制过程中,NaCl的渗透会引起蛋黄内脂肪酸等物质发生化学反应,进而使咸蛋黄的风味发生变化,同时蛋黄的色泽、口感和质构等理化指标也会发生变化[9-12]。有研究报道腌制过程中蛋黄理化性质的变化和品质的变化之间具有较强的相关性,AI等[13]研究指出咸蛋在腌制过程中,NaCl会引起蛋黄蛋白质分子间作用力的变化,导致蛋白质三、四级结构发生改变而形成凝胶。DOU等[14]研究发现在NaCl的渗透作用下,蛋黄内部分脂质游离出来,在O2的参与下脂肪酸的组成发生改变,从而形成蛋黄“出油”的特性。然而,咸鸭蛋腌制过程中蛋黄的挥发性成分的变化规律尚未清晰。此外,三穗鸭蛋与其他鸭蛋在营养成分和挥发性物质组成上均存在差异,导致腌制中蛋黄挥发性风味物质的变化规律更为复杂,但目前关于三穗咸鸭蛋的风味物质变化等方面的理论研究鲜有报道。因此以三穗鸭蛋黄为对象,研究两段式腌制过程中蛋黄挥发性风味物质的变化规律十分必要。

本研究以本课题组研制的两段式腌制为基础,采用GC-MS对腌制过程中蛋黄的挥发性成分进行定性和定量分析,探究咸蛋黄腌制过程中挥发性风味物质的变化规律。利用正交偏最小二乘法预测不同腌制阶段的咸蛋黄在挥发性物质组成上的差异,并对咸蛋黄风味差异有主要贡献作用的物质进行筛选,旨在探究两段式腌制工艺下,三穗咸鸭蛋蛋黄的挥发性风味变化,从而为三穗咸鸭蛋的两段式腌制技术提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三穗麻鸭蛋、食盐、红星二锅头,购买于贵阳市花溪区合力超市。

1.2 仪器与设备

FA2002B型分析天平,上海越平科学仪器有限公司;GZX-GF101-3-BS-Ⅱ型电热鼓风干燥箱,上海贺德试验设备有限公司;50/30umCAR/PDMS/DVB型手动固相微萃取装置,美国Supelco公司;SCIONSQ-456-GC型气相色谱质谱联用仪,美国布鲁克公司。

1.3 实验方法

1.3.1 咸蛋黄的制备

咸蛋腌制液配制:第一阶段腌制液为25%的食盐溶液;第二阶段腌制液为食盐10%、香辛料0.6%、白酒0.7%(均为质量分数),工艺流程如下:

三穗麻鸭蛋→洗净晾干→第一阶段腌制8 d→取出晾干→第二阶段腌制20 d

1.3.2 样品预处理和挥发性风味成分测定

取捣碎均匀的5.0 g咸蛋黄样品置于20 mL顶空瓶中,将老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分,于60 ℃吸附30 min,吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口,于250 ℃热解析3 min,同时启动仪器采集数据。

GC条件:色谱柱为DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管柱;载气为高纯He(99.999%);恒流,载气流速1.0 mL/min;升温程序,初始40 ℃,保持3 min,10 ℃/min升温至230 ℃,保持5 min;汽化室温度250 ℃。

MS条件:离子源为EI源;发射电流1.0 mA;电子能量70 eV;界面温度250 ℃;离子源温度200 ℃;检测电压2 000 V。

1.3.3 咸蛋黄挥发性成分的定量与定性

对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对NIST14和Wiley275标准质谱图,结合保留指数(retention index, RI值)为定性依据,确定挥发性化学成分的种类;用峰面积归一化法测定各化学成分的相对含量。

1.3.4 正交偏最小二乘法判别分析

将不同腌制阶段的蛋黄挥发性物质的相对含量进行正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA),利用解释变量(R2Y)和预测能力(Q2Y)验证模型的有效性,同时验证模型是否存在过拟合现象。

1.3.5 潜在差异物质的筛选和鉴定

根据OPLS-DA模型中的投影变量重要性因子(variable importance in projection,VIP),即VIP值筛选潜在的差异特征物质。

1.4 数据分析

运用Excel 2019整理数据,Origin 2018、SIMCA 14.1 和TBtools软件绘制图形。

2 结果与分析

2.1 腌制过程中咸鸭蛋蛋黄挥发性风味成分组成

图1为腌制过程中鸭蛋黄的总离子流图(total ion chromatogram,TIC),表1和图2为蛋黄中具体的挥发性风味物质及其相对含量的变化图。由图1可知,鲜蛋黄中检出31种挥发性风味物质,腌制7和14 d的蛋黄检出36种,腌制21 d的蛋黄检出37种,腌制28 d的蛋黄检出42种,说明随着NaCl的渗入,蛋黄的风味发生了显著的变化。

图1 腌制过程中蛋黄的总离子流图Fig.1 TIC for fresh duck egg yolk

由表1可知,腌制过程中蛋黄醛类物质的种类最为丰富,共有14种,其中3-苯基-2-丙烯醛、(E)-2-庚烯醛和对甲氧基苯醛3种物质在鲜蛋黄中未检出,而鲜蛋黄中(Z)-2-庚烯醛在盐水腌制的作用下消失。由图2可知,在腌制前14 d醛类物质含量升高速率较快,可能原因之一是NaCl的渗透促进了蛋黄中不饱和脂肪酸的氧化分解作用和氨基酸的Strecker降解,从而生成较多的醛类物质[15-16]。另一方面,腌制液中所添加的香辛料也对醛类等挥发性风味物质产生影响。

烷烯烃类物质主要来源于脂肪酸烷氧自由基的均裂,烷烃类物质感觉阈值较高,一般认为对食品的整体风味贡献较小[17-18]。表1展示了腌制过程中共检测出的9种烷烯烃类物质,由表1可知,鲜蛋黄中烷烯烃类物质相对含量最高(39.949%),随着腌制时间的延长,其相对含量呈现下降的趋势,最终降低至23.159%。腌制过程中烷烯烃类物质相对含量的降低是食盐的渗透作用导致的,这与吴涵等[19]关于腌制对鱼肉风味物质的影响的研究结果相似。另外,茴香烯在鲜蛋黄中未检出,而在腌制的蛋黄中出现,并且其相对含量随腌制时间的延长呈升高的趋势,因茴香烯主要存在于香辛料中[20],故判断咸蛋黄中茴香烯相对含量的升高来源于腌制中所添加的香辛料。

醇类物质一般是由脂肪氧化分解或羰基化合物还原而生成的,其风味阈值较高,对食品的风味影响较小[21-22]。从表中可以看出,腌制7 d后,蛋黄中醇类化合物相对含量由10.642%增加至16.91%,之后的7 d其相对含量又降低至9.509%,并在腌制后半段(14～28 d)未有明显变化,相对含量维持在10%左右。分析其原因,可能是由于腌制第一阶段中腌制液的盐浓度较高,高渗透压促进了体系内脂肪氧化分解和羰基化合物还原,从而使醇类物质迅速提高。而腌制第二阶段中体系内渗透压发生变化,抑制了醇类物质的生成而促进了其他反应的发生,已生成的醇类化合物又被转化为其他挥发性物质[23-24]。

酮类物质是脂肪氧化的另一主要产物,酮类物质具有特别的清香和花香风味,且呈味较持久[25]。由表1和图2可知,酮类物质相对含量较低,在腌制前7 d呈现上升的趋势,而在腌制14～28 d呈现下降的趋势。另外仅在腌制21 d与28 d后的咸鸭蛋黄中检测出2-壬酮,相对含量分别为0.366%和0.269%。

由表1可知,蛋黄中酯类和醚类化合物种类较少。在整个腌制过程中仅检测出3-丁烯基异硫氰酸酯和丙酸丁酯2种酯类化合物。随着腌制液的渗入,蛋黄中3-丁烯基异硫氰酸酯的相对含量由3.425%降低至0.269%,而丙酸丁酯在盐水腌制的作用下消失。蛋黄中醚类化合物也会受到NaCl的影响,其中二甲基三硫醚随腌制时间延长呈先升高后降低的趋势,而二丁醚只在腌制后期(21～28 d)被检测出,其相对含量在0.185%～0.249%范围之间。1,3-二氯苯和乙苯等芳香族化合物也参与了咸鸭蛋黄风味的形成,在腌制过程中,蛋黄芳香族挥发性物质含量呈先升高后降低的趋势,这与醇类物质的测定结果相类似。余平莲[26]研究指出咸蛋黄中1,3-二氯苯等物质的生成来自胆固醇的氧化,较高浓度的NaCl能够抑制这一氧化反应,因此芳香族类化合物的相对含量在腌制后期逐渐下降。

a-相对含量;b-种类数图2 咸蛋黄腌制过程中风味物质相对含量变化Fig.2 Change of flavor substance categories in salted egg yolk curing process

2.2 基于正交偏最小二乘法的咸蛋黄风味差异分析

OPLS-DA是一种有监督的逻辑回归模型,该模型能够较为准确地体现各个样品之间的差异,并按照差异物质的相关性将样品进行分类。投影变量重要性因子是OPLS-DA中的重要参数之一,它可量化OPLS-DA中每个变量对样本分类的贡献度,从而有助于筛选潜在的差异特征物质。VIP值>1说明该物质对咸蛋黄的风味差异有主要的贡献作用,VIP值越大说明该物质在样品间的差异越显著[27-29]。

本试验将所测咸蛋黄挥发性成分的相对含量进行正交偏最小二乘法判别分析,旨在对不同腌制阶段的咸蛋黄挥发性风味物质组成进行差异性分析。该模型中,解释变量(R2Y)和预测能力(Q2Y)分别为0.99和0.96,说明该模型对咸蛋黄的差异性风味物质的预测和筛选是有效的,下面将对OPLS-DA结果进行分析和讨论。

2.2.1 不同腌制阶段蛋黄挥发性物质的差异性分析

由图3可知,不同腌制时期的咸蛋黄在挥发性组分上存在组间差异,且组内样本的一致性较好。在X轴上,未腌制的和盐水腌制的咸蛋黄之间存在显著的差异,说明盐水的渗透能够使咸蛋黄的挥发性成分发生较大的变化。在Y轴上,腌制7 d与14 d的咸蛋黄挥发性物质相对含量差异较小,而腌制14、21和28 d咸蛋黄的挥发性物质相对含量差异显著,由此可将咸蛋黄的挥发性成分组成变化大致分为0～14 d、14～21 d和21～28 d 3个阶段。

图3 不同阶段的蛋黄OPLS-DA得分图Fig.3 OPLS-DA score of egg yolk at different stages

2.2.2 不同腌制阶段蛋黄的潜在差异风味物质分析

如图4所示,红色标记的物质为筛选出的VIP值>1的物质,包括3-辛烯-2-醇、3-苯基-2-丙烯醛、苯乙醇、3-辛酮、对甲氧基苯醛、1,3-二氯苯、2,5-二甲基吡嗪、十三烷、(E)-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、5,6-十一碳二烯、间二甲苯、苯并吡咯、2-正戊基呋喃、对二甲苯、甲基肼、乙苯、苯甲醛、正己醇、二丁醚、正庚醇、3-丁烯基异硫氰酸酯、磺酰基二甲烷、丙酸丁酯、(Z)-2-庚烯醛、正十七烷等26种挥发性物质。其中3-辛烯-2-醇(VIP=1.205)、3-苯基-2-丙烯醛(VIP=1.202)、苯乙醇(VIP=1.163)、3-辛酮(VIP=1.144)、对甲氧基苯醛(VIP=1.136)、1,3-二氯苯(VIP=1.119)、2,5-二甲基吡嗪(VIP=1.084)等物质VIP值相对较大,推测可能是影响咸蛋黄香味差异的重要挥发性物质。

图4 挥发性风味物质VIP值Fig.4 VIP value of volatile flavor substances

2.2.3 蛋黄差异风味物质的层次聚类分析

为了直观地体现各腌制阶段咸蛋黄挥发性风味物质特征的差异,将OPLS-DA筛选出的27种挥发性物质进行层次聚类分析,并利用热图进行展示。如图5所示,颜色表示各物质相对含量的高低,蓝色越深表示其相对含量越低,红色越深表示其相对含量越高。从图中可以看出,5个腌制阶段的咸蛋黄可按照其挥发性物质组成的差异分为2类,第一类是未腌制的咸蛋黄(0 d),第二类是腌制7 d至28 d的咸蛋黄,这与2.2.1节中OPLS-DA分析的结果相类似。腌制结束后,5,6-十一碳二烯、正庚醇、3-辛酮、反-2-辛烯醛、(E)-2-庚烯醛、苯甲醛、(Z)-1-丁烯醛、己醛和2,5-二甲基吡嗪的相对含量较高。其中3-辛酮、反-2-辛烯醛、(E)-2-庚烯醛、(Z)-1-丁烯醛、己醛和2,5-二甲基吡嗪香气阈值较低,对咸蛋黄的风味影响较大,并赋予了咸蛋黄苦杏仁、青草、柑橘、油脂香、水果香和花香等多种风味[30-31]。其他阈值较大且相对含量在腌制中呈上升趋势的挥发性物质作为香气前体物质或助香物质,与主要的风味物质协调而形成咸蛋黄的风味特征。对二甲苯、乙苯、甲基肼、正十七烷、3-丁烯基异硫氰酸酯、磺酰基二甲烷、(Z)-2-庚烯醛和丙酸丁酯等物质在鲜蛋黄中相对含量较高,而在腌制过程中相对含量较低,由此推测是蛋黄呈腥味的重要物质。

图5 不同腌制阶段咸蛋黄的差异风味物质聚类分析热图Fig.5 Heat map of cluster analysis of differential flavor substances of salted egg yolk at different curing stages

3 结论

GC-MS检测结果表明在两段式腌制过程中,三穗鸭蛋蛋黄的挥发性风味物质的含量会发生显著变化。经过腌制,蛋黄的挥发性风味物质种类显著增多,由鲜蛋黄的31种到腌制结束后的42种,其中对咸蛋黄风味影响较大的有醛、醇、酮、酯、芳香族、烷烯烃等6类挥发性物质。在腌制液中添加香辛料能够使蛋黄内茴香烯等挥发性物质的含量显著提高,并赋予咸蛋黄特殊的香味。OPLS-DA和聚类分析的结果说明NaCl能显著改变鸭蛋黄的挥发性成分的组成,并且随着蛋黄内盐浓度的提高,各腌制时期的蛋黄挥发性组分的差异越显著。蛋黄中3-辛烯-2-醇、3-苯基-2-丙烯醛、苯乙醇、3-辛酮、对甲氧基苯醛、1,3-二氯苯、2,5-二甲基吡嗪等物质的VIP值相对较大,是影响咸蛋黄特征风味差异的重要挥发性物质。此外,对二甲苯、乙苯、甲基肼、正十七烷、3-丁烯基异硫氰酸酯、磺酰基二甲烷、(Z)-2-庚烯醛和丙酸丁酯等8种VIP值>1的物质,在未腌制的鸭蛋黄中相对含量较高,在腌制过程中相对含量较低,推测是贡献蛋黄腥味的潜在物质。