交泰丸穴位贴敷对心肾不交失眠模型大鼠HPA 轴相关激素的影响

赵心含 胡霖霖

失眠是临床多发病、常见病，表现为入睡困难和/或难以维持睡眠，导致患者对睡眠时间或质量不满意[1]。失眠影响全球约22%的成年人，且发病率呈现上升趋势[2]。长期失眠患者常伴有不同程度的抑郁和焦虑，明显影响患者的生活质量[3-4]。交泰丸穴位贴敷是一种操作简单、副作用小且疗效肯定的治疗方法，但是其作用机制尚未明确[5]。研究表明，应激引起的下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能的紊乱可表现为睡眠的开始和持续困难，因此调节HPA 轴亢进已成为治疗失眠的关键靶标[6]。本研究采用对氯苯丙氨酸（PCPA）腹腔注射和多因素共同作用建立大鼠失眠模型，研究交泰丸穴位贴敷对下丘脑病理损伤修复和HPA 轴相关激素的影响，探讨交泰丸防治失眠的作用机制。

1 材料及方法

1.1 实验动物 健康、雄性成年SD 大鼠50 只，体质量（250±50）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2022-0004。于浙江中医药大学SPF 级科研实验动物中心饲养，实验动物使用许可证号为SYXK（浙）2021-0012，温度（23±2）℃，湿度（56±2）%，依照实验动物标准进行进食和饮水，并遵循12 h 进行明暗循环处理。本实验全程严格遵守浙江中医药大学动物实验伦理规范（伦理批准编号：IACUC-202206-0454）。

1.2 主要药物 交泰丸组方成分为黄连（浙江英特医药药材有限公司，批号202203016）和肉桂（华东医药股份有限公司，批号20220822）以10∶1 配比，由浙江中医药大学附属杭州市中医院制药厂研磨成细粉，再以醋和氮酮调配。艾司唑仑片（山东信谊制药有限公司，批号2360712）。

1.3 仪器及试剂 酶联免疫检测仪（MK3FC 型，美国Thomer Fisher 公司）；RM2255 全自动轮转切片机（Leica Microsystems，Inc）；HE 染色机（Leica 公司）；贝克曼Allegra X-15R 高速台式冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）等。促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号MM-0520R1）、促肾上腺皮质激素（ACTH）（批号MM-0565R1）、皮质酮（CORT）试剂盒（批号MM-0559R1），均购自江苏酶免实业有限公司。

1.4 失眠模型的建立 采用腹腔注射PCPA 和多因素共同刺激的方法复制失眠动物模型[7]。除空白对照组外，其余各组大鼠分别于第8～21 天随机给予以下刺激：四肢束缚2 h、4 ℃冰水游泳5 min、禁食禁水24 h、夹尾1 min、明暗颠倒24 h、鼠笼倾斜45°24 h、潮湿垫料24 h，每天仅接受一种刺激且相邻2 天的刺激不重复，第22～24 天上午8∶00～8∶30 腹腔注射PCPA 混悬液（450 mg/kg），连续给药3 d。

1.5 分组和干预方法 适应性喂养1 周后，按随机数字表法分为5 组：空白对照组、模型组、穴位贴敷组、艾司唑仑组、联合干预（穴位贴敷联合艾司唑仑）组，每组10 只，标记后称重。造模完成后第2 天，穴位贴敷组和联合干预组参照《实验针灸学》取心俞（双侧）、肾俞（双侧）、神阙、涌泉（双侧）贴敷0.5 cm×0.5 cm 的交泰丸药饼，每天1 次，每次1 h，连续14 d。艾司唑仑组：造模成功后第2 天上午8∶00 给予0.3 mg/kg 艾司唑仑灌胃，连续14 d。联合干预组：在穴位贴敷的基础上给予0.3 mg/kg 剂量的艾司唑仑灌胃14 d（以下称为联合干预组）。空白对照组和模型组大鼠进行相同时间的抓取固定，但不进行其他干预。

1.6 大鼠一般情况 每日观察大鼠行为状态、生理状态、睡眠情况、毛发情况、活跃程度、精神状态、体质量及其他失眠引发的伴随症状。

1.7 戊巴比妥钠翻正实验 连续给药14 d，末次给药1 h 后，各组大鼠腹腔注射阈下剂量的戊巴比妥钠40 mg/kg，以大鼠能保持60 s 不翻动为入睡指标，以此记录睡眠潜伏期，翻动反射恢复为苏醒指标，以此记录睡眠时间。

1.8 ELISA 法检测血清和毛发中CRH、ACTH、CORT 含量 实验干预完成后，采集大鼠腹主动脉血3～5 mL、脑后及颈背部新生毛发，毛发用不锈钢碾磨成粉末加入甲醇溶解，静置后将血清和毛发匀浆液5000 g 离心5～10 min，取上清，根据ELISA 试剂盒制造商的说明书，测定血清和毛发内的CRH、ACTH、CORT 的含量。

1.9 HE 染色法观察大鼠下丘脑组织病理变化 采血结束后断颈，参照大鼠大脑立体定位图，用止血钳取出下丘脑，并用生理盐水洗去血污，放入10%的中性甲醛中固定24 h 以上，经过乙醇梯度脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红（HE）染色后在光学显微镜下观察下丘脑组织病理损伤。

1.10 统计学方法 应用SPSS 25.0 软件对数据进行统计分析。计量资料符合正态分布者以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，方差齐用LSD 检验进行两两比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 空白对照组大鼠的昼夜节律正常，白天安静多眠，夜晚较活跃，精神良好，皮毛光亮；与空白对照组比较，模型组大鼠昼夜节律紊乱甚至消失，白天活动增多，攻击性增加，精神状态欠佳，毛发黄失去光泽，失眠大鼠模型造模成功；干预后，与模型组比较，穴位贴敷组、艾司唑仑组和联合干预组三组大鼠昼夜节律恢复，白天活动减少，能入睡，精神改善，毛发恢复光泽。与空白对照组比较，模型组体质量增加缓慢（P＜0.05）；与模型组比较，穴位贴敷组、艾司唑仑组和联合干预组的增重显著（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠干预前后体质量比较（g，±s）

表1 各组大鼠干预前后体质量比较（g，±s）

注：空白对照组及模型组进行相同时间的抓取固定，但不进行其他干预；穴位贴敷组给予1 h 的交泰丸穴位贴敷；艾司唑仑组给予0.3 mg/kg艾司唑仑灌胃；联合干预组给予1 h 的交泰丸穴位贴敷和0.3 mg/kg艾司唑仑灌胃；与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别空白对照组模型组穴位贴敷组艾司唑仑组联合干预组鼠数10 10 10 10 10干预前体质量230.3±24.5 236.0±26.3a 239.1±27.4b 235.9±23.5b 235.9±23.5b干预后体质量383.1±15.1 298.1±36.5a 355.6±12.9b 347.8±22.5b 351.8±21.5b

2.2 各组大鼠戊巴比妥钠睡眠翻正实验结果比较与空白对照组比较，模型组失眠大鼠睡眠潜伏期明显延长（P＜0.05），睡眠持续时间明显缩短（P＜0.05）；与模型组比较，穴位贴敷组、艾司唑仑组和联合干预组的睡眠时间均延长（P＜0.05），睡眠潜伏期缩短（P＜0.05），戊巴比妥钠的催眠作用增强。提示交泰丸穴位贴敷后睡眠潜伏期减少，睡眠时间延长，对失眠大鼠具有良好的催眠作用，见表2。

表2 各组大鼠戊巴比妥钠睡眠翻正实验结果比较（±s）

表2 各组大鼠戊巴比妥钠睡眠翻正实验结果比较（±s）

注：空白对照组及模型组进行相同时间的抓取固定，但不进行其他干预；穴位贴敷组给予1 h 的交泰丸穴位贴敷；艾司唑仑组给予0.3 mg/kg艾司唑仑灌胃；联合干预组给予1 h 的交泰丸穴位贴敷和0.3 mg/kg 艾司唑仑灌胃与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别空白对照组模型组穴位贴敷组艾司唑仑组联合干预组鼠数10 10 10 10 10睡眠潜伏期（s）176.5±23.8 251.1±49.5a 199.8±28.0b 203.2±30.7b 203.9±38.6b睡眠时间（min）80.1±11.1 54.9±5.7a 71.7±13.6b 71.8±15.5b 71.8±15.5b

2.3 各组大鼠血清CRH、CORT、ACTH 水平比较与空白对照组比较，模型组大鼠血清CRH、CORT、ACTH 的水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，穴位贴敷组、艾司唑仑组和联合干预组的大鼠干预后血清ACTH、CORT 水平显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05），CRH 的下调虽无统计学意义，但有改善趋势，见表3。

表3 各组大鼠血清CRH、CORT、ACTH 水平（ng/L，±s）

表3 各组大鼠血清CRH、CORT、ACTH 水平（ng/L，±s）

注：空白对照组及模型组进行相同时间的抓取固定，但不进行其他干预；穴位贴敷组给予1 h 的交泰丸穴位贴敷；艾司唑仑组给予0.3 mg/kg艾司唑仑灌胃；联合干预组给予1 h 的交泰丸穴位贴敷和0.3 mg/kg 艾司唑仑灌胃；CRH 为促肾上腺皮质激素释放激素；CORT 为皮质酮；ACTH 为促肾上腺皮质激素；与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别空白对照组模型组穴位贴敷组艾司唑仑组联合干预组鼠数10 10 10 10 10 CRH 56.98±2.19 63.59±1.83a 61.23±2.23 61.48±1.50 61.24±1.42 CORT 93.00±2.95 99.73±1.09a 93.99±3.54b 94.10±2.78b 92.05±3.92b ACTH 138.24±2.71 144.74±1.15a 140.18±1.83b 140.27±2.11b 138.71±1.65b

2.4 各组大鼠毛发中CRH、CORT、ACTH 水平比较与正常组比较，模型组大鼠毛发中的CRH、CORT、ACTH 的水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，穴位贴敷组、艾司唑仑组和联合干预组大鼠干预后毛发中的CRH、CORT、ACTH 水平显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠毛发中CRH、CORT、ACTH 水平比较（ng/L，±s）

表4 各组大鼠毛发中CRH、CORT、ACTH 水平比较（ng/L，±s）

注：空白对照组及模型组进行相同时间的抓取固定，但不进行其他干预；穴位贴敷组给予1 h 的交泰丸穴位贴敷；艾司唑仑组给予0.3 mg/kg艾司唑仑灌胃；联合干预组给予1 h 的交泰丸穴位贴敷和0.3 mg/kg 艾司唑仑灌胃；CRH 为促肾上腺皮质激素释放激素；CORT 为皮质酮；ACTH 为促肾上腺皮质激素；与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别空白对照组模型组穴位贴敷组艾司唑仑组联合干预组鼠数10 10 10 10 10 CRH 56.46±1.76 61.29±0.742a 58.20±1.76b 57.66±1.53b 57.51±2.54b CORT 93.00±2.95 99.73±1.09a 93.99±3.54b 94.10±2.78b 92.05±3.92b ACTH 122.77±4.77 129.77±3.52a 123.00±1.71b 124.70±1.36b 123.30±3.44b

2.5 各组大鼠下丘脑组织HE 染色病理比较 空白对照组大鼠丘脑核团所在区域，毛细血管不扩张，数量不易识别，神经元排列有序紧密，分布均匀；模型组大鼠丘脑核团所在位置毛细血管扩张，数量增多，血管壁增厚，神经元排序混乱，排列疏松，胶质细胞增生，可见空泡变性；穴位贴敷组、艾司唑仑组、联合干预组大鼠丘脑核团毛细血管扩张不明显，壁无明显增厚，血管不增多，神经元有序排序，排列紧密。见图1。

3 讨 论

《内经》对“不寐”的病因阐述为“营卫失和，阳不入阴”，病机为营卫失调、脏腑损伤。中医典籍《辨证录》曾载：“盖日不能寐者，乃肾不交于心；夜不能寐者，乃心不交于肾也”。交泰丸是中医治疗心肾不交失眠的经典方，方中黄连性寒味苦，泻心火燥湿；肉桂辛热导火，补元阳除积冷，两药配伍使心火下降，肾水上济，水火既济而阴阳交泰。本研究采用腹腔注射PCPA 和多因素共同刺激复制失眠动物模型，造模后大鼠表现出昼夜节律紊乱，白天活动增多，攻击性增加，精神萎靡，毛发枯槁等症状，与中医临床证候中心肾不交失眠的表现相符。本研究失眠模型大鼠行为学与杨钰涵等[7]的心肾不交失眠大鼠表现一致。故本研究选择交泰丸作为心肾不交失眠的辨证治疗药物。

穴位贴敷以中医经络理论为依据，辨证选取经络、穴位和中药，将针灸疗法与中药疗法的优势相结合，从而达到内病外治目的。本研究选取的心俞、肾俞位于足太阳膀胱经，心俞可以泻心火下交于肾，肾俞则补肾阳上济于心，涌泉穴位于足少阴肾经，诸穴合用可引气血下行。神阙穴为穴位贴敷治疗失眠的常用穴，具有明确的镇静安神作用。本研究选择的交泰丸穴位贴敷是将治疗心肾不交失眠的中药外敷，经过透皮作用吸收，再加上穴位的刺激作用，融于气血，由经脉入脏腑，直达病灶，因此睡眠得以改善。戊巴比妥钠睡眠翻正实验结果提示了交泰丸穴位贴敷能显著延长戊巴比妥钠诱导的大鼠的睡眠时间，加快大鼠入睡时间，其中交泰丸穴位贴敷联合艾司唑仑效果最佳，提示交泰丸穴位贴敷可以起到加强镇静和催眠作用。本研究取大鼠下丘脑组织通过HE染色法观察，发现交泰丸穴位贴敷可以减少下丘脑核团毛细血管扩张和神经元排序，一定程度上改善下丘脑的病理损伤。

研究报道对大鼠的物理刺激会导致HPA 轴的激活，HPA 轴在参与机体的各种应激反应、保持警觉和调节睡眠方面起重要作用[8]。下丘脑室旁核可通过负反馈机制调节血清CRH、ACTH、CORT 激素水平，从而平衡HPA 轴。较高水平激活的HPA 轴会使ACTH、CRH、CORT 合成和分泌增多，导致睡眠变浅和夜间清醒时间增加[9]。长时间的应激会导致HPA轴调节能力减弱，导致失眠的恶性循环[10]。临床研究发现失眠症患者血浆CRH、ACTH、CORT 含量均升高，HPA 轴功能亢进，因此平衡HPA 轴是治疗失眠的关键方法[11]。本实验同时取大鼠的新生毛发和血清进行对比分析，ELISA 结果检测发现与模型组比较，穴位贴敷组、艾司唑仑组、联合干预组干预后毛发中的ACTH、CRH 和CORT 的激素均降低，血清ACTH和CORT 的激素水平降低。研究结果提示经过穴位贴敷和艾司唑仑单独或联合干预后，大鼠的睡眠情况得到改善，穴位贴敷联合艾司唑仑疗效更优。本研究显示交泰丸穴位贴敷一定程度缓解PCPA 失眠大鼠的HPA 轴过激状态，且可协同艾司唑仑起到更好的疗效。

本研究结果显示血清CRH 水平仅有降低趋势，无统计学意义，这可能与侵入性的采血操作伴随着额外的压力有关。现代研究发现，血清皮质醇反映的是总皮质醇的量，受昼夜节律、取样操作等刺激影响较大，而毛发样本反应的是游离皮质醇，可反映长期HPA 轴是否平衡。因此毛发样本相对于血清样本更具有稳定性，这与El 等[12]的研究结果一致。大鼠毛发的生长规律与人类不同，大鼠成年后毛发长度基本不变，不能反映在过去一段时间内皮质醇的水平变化。因此我们在实验前剃除了大鼠的脑及背颈部毛发，采集新生毛发作为样本，发现新生毛发才可以反映实验周期内皮质醇的水平变化。

综上所述，交泰丸穴位贴敷可以一定程度上改善大鼠失眠症状，其机制可能与通过下调CRH、CORT、ACTH 激素水平从而平衡HPA 轴有关，且新生毛发相对于血清更具有稳定性。