加味生肌玉红膏对肛瘘模型大鼠术后创面的作用及血清炎症因子水平的影响

梅苹苹,郭修田,冯文哲,林 璐

(1.上海中医药大学附属市中医医院,上海 200071;2.陕西中医药大学附属医院肛肠科,陕西 咸阳 712000)

肛瘘病名最早记载于《山海经·中山经》：“食者不痈,可以为瘘”,指出了肛瘘多是由肛门周围脓肿破溃后引起的后遗疾患[1],肛瘘的发病率约占正常人群的1.04%～3.6%,且复发率较高[2]。目前临床治疗肛瘘主要以手术为主,但是由于手术方式为开放式,创口易被粪便污染,通常不进行缝合,易感染,出现渗液、水肿、炎症反应及疼痛等影响创面愈合,给患者生活造成巨大不便。因此,减轻肛瘘术后创面的炎性反应,促进创面愈合已经成为临床关注的重点。中医学认为湿热下注是肛瘘的根本病机,而湿热邪气的致病特点与炎症密切相关[3]。本研究针对肛瘘术后创面早期湿热内蕴明显的病机特点,在煨脓长肉治法的指导下,我们在生肌玉红膏原方的基础上,增加并调整了祛湿清热功效的药物及剂量,使祛湿清热作用更加突出,观察加味生肌玉红膏对肛瘘模型大鼠创面愈合率及血清中白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)及血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的变化,现总结如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：60只SPF级雄性SD大鼠,周龄为8～10周,体重175～215 g,均由西安交通大学医学部实验动物中心提供[生产许可证号：SCXK(陕)2018-001]。实验经陕西中医药大学伦理委员会批准,伦理委员会审批号：SUCMDL20210608001。实验前开始适应性喂养2周,大鼠饲养于陕西中医药大学动物实验中心。饲养条件：室温保持在20～25 ℃,环境湿度40%～60%,普通饲料喂养,自由饮水饮食。

1.1.2 药物制作：加味生肌玉红膏药物(苍术、黄柏、当归、白蜡各60 g,白芷15 g,轻粉、血竭各12 g,紫草6 g,甘草36 g)的制备方法：先将苍术、黄柏、当归、白芷、紫草、甘草六味入油内浸3 d,然后文火熬枯去渣;再入血竭化尽,次入白蜡微火化开,待油温后,再入研细轻粉搅匀,冷却后即凝成膏,4 ℃冰箱保存。由陕西中医药大学附属医院制剂中心生产,符合 GMP标准。

1.1.3 主要试剂：二甲苯(国药集团,批号：10023418);苏木素-伊红染液(南昌雨露实验器材有限公司,批号：171007);医用凡士林纱布(山东安捷高科消毒科技有限公司,批号：2021110219);康复新液(四川好医生攀西药业有限公司,批号：B220223);ELISA检测试剂盒(Beyotime,批号：E-TSELH0029);中性树胶(金华力升实验器材厂,批号：20171118);4%多聚甲醛组织固定液(Biosharp,批号：70071800);NF-κB信号通路抑制剂(PDTC)(西安灏洋生物技术有限公司,批号：P9701-25g);粪便混悬液：取新鲜大鼠粪便20 g,与0.9%氯化钠溶液1∶1均匀混合,5000 r/min,离心5 min,取上清液备用。

1.1.4 主要仪器：实验用电泳仪电源(北京六一仪器厂,型号：DYY-7C);垂直电泳槽(北京六一仪器厂,型号：DYCZ-24DN);电转仪(北京六一仪器厂,型号：DYCZ-40);切片盒(海门市杰锐思实验器材厂,型号：20016532);石蜡切片机(沈阳恒松科技有限公司,型号：HS-S7220-B);其他仪器均由陕西中医药大学实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 造模与分组：在付小兵等[4]制作创面模型的基础上做适当改良：取 60 只体重达标的大鼠,实验当天禁食,3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉。标记4 cm×4 cm面积剔除背部毛发,备皮区域用乙醇棉球消毒,大鼠背部制备一个2.0 cm×2.0 cm的正方形,按印记制备一个破坏皮肤全层并深达筋膜的正方形创面,避开大血管,查无活动性出血后,于创面滴洒0.5 ml粪便混悬液,并用医用纱布覆盖、包扎。3 d后取下纱布并观察创面可见较多脓性分泌物,表示伤口已发生急性感染,即为造模成功。共造模成功60只,按随机数字表法分成凡士林组10只,康复新液组10只、加味生肌玉红膏组10只、PDTC+康复新液组10只、PDTC+凡士林组10只、PDTC+加味生肌玉红膏组10只。

1.2.2 实验给药：造模成功后,每日清晨于大鼠创面滴洒粪便混悬液 0.5 ml,1 h后用0.9%氯化钠溶液棉球清创,并用无菌干棉球擦拭分泌物。凡士林组(凡士林0.3 g/只)均匀涂抹伤口,康复新液组(康复新液0.3 ml/只)均匀涂抹创面,加味生肌玉红膏组(加味生肌玉红膏0.3 g/只)完全覆盖创面,PDTC+康复新液组、PDTC+凡士林组和PDTC+加味生肌玉红膏组需在药物干预基础上,给予NF-κB信号通路抑制剂 PDTC 100 mg/kg 腹腔注射,每日1次,连续 5 d。各组换完药后用医用纱布覆盖,胶带绑定。

1.2.3 一般情况：每日观察大鼠进食、饮水及活动情况,换药前或更换纱布时观察创面情况：分泌物,感染,水肿,肉芽生长情况等。

1.2.4 创面愈合率：分别在干预3、7、14 d时记录相关数据,创面用保鲜膜覆盖,用记号笔描绘各组大鼠创面图形,取保鲜膜紧密贴合于心电图图纸上,测量创面大小,记录创面面积(cm2),计算创面愈合率。创面愈合率=(初始创面面积-当前创伤面积)/初始创面面积×100%。

1.2.5 血清VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6表达检测：各组大鼠在给药3、7、14 d时麻醉大鼠,大鼠尾静脉抽取血样2 ml,将血液温水浴20 min后,5000 r/min离心15 min,留取血清,按ELISA测试试剂盒说明书进行检测,用酶标仪在450 nm波长测量VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6的OD值,绘出曲线并计算出直线回归方程式,将OD值代入并计算出蛋白浓度。

2 结 果

2.1 加味生肌玉红膏对大鼠一般情况及创面愈合情况的影响 全程无样本脱落,造模后第1天大鼠进食及活动量均较前明显减少,各组创面情况均较差,水肿明显,渗液较多,且表面覆有脓性分泌物;治疗后第3天,大鼠饮食与活动量比造模当日稍改善,凡士林组与康复新液组可见高度组织水肿,明显皮肤结构损伤,局部分泌物较多,加味生肌玉红膏组、PDTC+康复新液组、PDTC+凡士林组和PDTC+加味生肌玉红膏组创面炎症比治疗前稍减轻;第7～14天,各组大鼠创面逐渐出现痂皮覆盖,去除痂皮可见康复新液组、凡士林组及PDTC+凡士林组创面水肿,仍有部分炎症,创面较前缩小不明显,而加味生肌玉红膏组、PDTC+康复新液组、PDTC+加味生肌玉红膏组创面水肿不明显,创面较前明显缩小,爬皮明显;第21天时,各组已趋于愈合,除凡士林组和康复新液组外其余各组大鼠创面愈合较快,大部分PDTC+加味生肌玉红膏组及加味生肌玉红膏组大鼠接近完全愈合。

2.2 加味生肌玉红膏对大鼠创面愈合率的影响 见表1。给药第3、7、14天,加味生肌玉红膏组与PDTC+加味生肌玉红膏组创面愈合率显著高于其余各组,差异有统计学意义(P<0.05)。给药第3天,凡士林组、康复新液组、PDTC+凡士林组及PDTC+康复新液组创面愈合率差异无统计学意义(P>0.05)。给药第7、14天,凡士林组的创面愈合率最低(P<0.05),PDTC+加味生肌玉红膏和加味生肌玉红膏组创面愈合率高于其余各组(P<0.05)。

表1 各组大鼠不同时间创面愈合率(%)

2.3 ELISA法检测大鼠不同时间血清VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6的表达量 在给药后第3天IL-1β表达达到峰值,凡士林组含量最高,康复新液组与凡士林组IL-1β表达含量明显高于加味生肌玉红膏组(P<0.05),PDTC+加味生肌玉红膏组、PDTC+康复新液组含量低于其余各组(P<0.05);给药第7、14天,PDTC+加味生肌玉红膏组IL-1β表达含量明显低于其余各组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠不同时间IL-1β表达情况(ng/ml)

在给药第3天TNF-α表达达到峰值,凡士林组含量最高,康复新液组与凡士林组TNF-α表达含量明显高于加味生肌玉红膏组(P<0.05),PDTC+加味生肌玉红膏组、PDTC+康复新液组TNF-α含量低于其余各组(P<0.05);给药第7天,PDTC+加味生肌玉红膏组TNF-α表达含量明显低于其余各组(P<0.05);给药第14天,TNF-α含量较前明显降低,PDTC+加味生肌玉红膏组TNF-α含量最低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠不同时间TNF-α表达情况(ng/ml)

在给药第3天IL-6表达达到峰值,凡士林组含量最高,康复新液组与凡士林组TNF-α表达含量明显高于加味生肌玉红膏组(P<0.05),PDTC+加味生肌玉红膏组IL-6含量低于其余各组(P<0.05);给药第7天,PDTC+加味生肌玉红膏组IL-6表达含量明显低于其余各组(P<0.05),加味生肌玉红膏组IL-6表达含量与康复新液组比较差异无统计学意义(P>0.05),但明显低于凡士林组(P<0.05);给药第14天,IL-6含量较前明显降低,PDTC+加味生肌玉红膏组IL-6含量最低(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠不同时间IL-6表达情况(ng/ml)

给药第3天,凡士林组的VEGF含量最低(P<0.05);给药第7天,各组VEGF含量逐渐升高,PDTC+加味生肌玉红膏组VEGF含量高于其余各组(P<0.05),加味生肌玉红膏组VEGF含量明显高于康复新液组与凡士林组(P<0.05);给药第14天,VEGF含量较第7天稍低,PDTC+加味生肌玉红膏组与加味生肌玉红膏组VEGF表达含量差异无统计学意义(P>0.05),但高于其余各组(P<0.05),加味生肌玉红膏组VEGF表达含量明显高于凡士林组与康复新液组(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠不同时间VEGF表达情况(ng/ml)

3 讨 论

目前肛瘘最普遍采用的治疗方式仍是手术,然而肛周皮肤娇嫩,肛门处痛觉神经丰富,肛瘘手术后的创面因粪便污染及排便过程中的机械性损伤,容易出现疼痛、水肿、出血、愈合缓慢等并发症,进而严重影响患者的休息、进食、活动,从而影响肛瘘患者术后的恢复[5-7]。因此解决肛瘘术后创面愈合这一难题,已成为临床医生关注的重点。

生肌玉红膏出自《外科正宗》,作为外治创面的经典药方,具有祛腐生肌,活血止痛的功效,临床疗效得到了广泛的认可。本研究采用陕西中医药大学附属医院制剂中心制备的加味生肌玉红膏,药物组成为：苍术、白芷、轻粉、黄柏、当归、甘草、白蜡、紫草、血竭等。其中甘草、黄柏有清热解毒,消肿止痛的作用;苍术、白芷有祛病除湿,排脓生肌,活血止痛等功效;当归能活血化瘀,还具有润燥滑肠的作用;紫草具有活血、凉血、清热解毒作用,对热结便秘具有较好疗效,与当归合用可以改善局部组织血液循环;血竭可化瘀止血,活血止痛;白蜡具有止血生肌的作用,轻粉则具有攻毒杀虫,祛腐敛疮的作用。诸药合用制成加味生肌玉红膏,可生肌止痛,解毒消肿,对红肿、溃烂、流脓液的肛瘘术后创面具有较好的治疗效果。本研究发现在治疗的各个时间点,加味生肌玉红膏组与PDTC+加味生肌玉红膏组创面愈合率显著高于其余各组,差异有统计学意义,且通过对创面观察发现,凡士林组主要以瘢痕修复为主,且部分伴有创面水肿,加味生肌玉红膏组与PDTC+加味生肌玉红膏组创面较前明显缩小,爬皮明显,甚至部分创面已有毛发覆盖,修复良好。表明加味生肌玉红膏可以有效促进创面愈合。

本研究针对肛瘘术后创面早期湿热内蕴明显的病机特点,在煨脓长肉治法的指导下,在生肌玉红膏原方的基础上,增加并调整了祛湿清热功效的药物及剂量,使祛湿清热作用更加突出。中医学认为湿热下注是肛瘘的根本病机,而湿热邪气的致病特点与炎症密切相关。张旭峰等[8]研究发现湿热体质的患者体内炎症因子水平高于平和体质患者。有学者[9]证实,湿热下注证患者的肿瘤坏死因子、白细胞介素-4、白细胞介素-10等炎性指标可明显增高。湿热流注肛门而致创面难敛,炎性反应又是肛瘘术后恢复缓慢的重要原因。NF-κB作为重要的转录因子,在炎症性应激反应中占有重要的地位。已有研究证实NF-κB可高效诱导多种细胞因子,包括IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表达[10-12]。TNF-α、IL-6是最常见的炎性因子,可导致肛瘘术后多种并发症的发生[13-14]。IL-6是一种由多种细胞合成并分泌的炎性因子,在机体免疫调节中发挥关键作用,是机体关键炎症递质和调节因子[15]。IL-1是炎性反应和免疫应答中的重要细胞因子,其中,IL-1β在宿主对抗炎性反应的开始和发展阶段,可启动炎症的级联反应,激活丝裂原活化蛋白酶通路,对创面愈合造成不良影响[16-17]。TNF-α具有广泛的功能,它可以促进抗炎呈递,诱导炎症细胞活化、聚集,刺激机体局部炎性反应,还可与IL-1β相互作用加重炎性反应[18]。本研究结果显示,在给药后第3天IL-1β、TNF-α、IL-6表达达到峰值,凡士林组含量最高。治疗各时间点加味生肌玉红膏组的IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表达显著低于凡士林组与康复新液组。给予NF-κB信号通路抑制剂PDTC 100 mg/kg腹腔注射后,治疗第7、14天PDTC+加味生肌玉红膏组IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达含量最低,表明加味生肌玉红膏可有效抑制肛瘘术后创面的炎性反应。创面增生的关键阶段,需要伤口内基底部肉芽组织的新血管生成[19],而生长因子参与细胞的生长、增殖、分化和迁移,从而促进肉芽的生长,加速上皮化[20-21]。VEGF作为目前已知最强的促血管内皮生长因子,在受损伤组织中发挥重要作用[22-23]。有研究证实,VEGF高表达的同时可刺激血管内皮细胞增殖,促进血管生成,加速创面愈合[24-25]。本研究结果显示,VEGF在治疗后第3天,凡士林组表达含量最低,之后各组VEGF含量逐渐升高,治疗后第14天,VEGF含量较第7天稍低,而治疗各时间点PDTC+加味生肌玉红膏组与加味生肌玉红膏组VEGF表达含量显著高于凡士林组与康复新液组,证实了加味生肌玉红膏可以促进VEGF蛋白的表达,促进血管形成,从而促进创面愈合。

综上所述,加味生肌玉红膏可能通过NF-κB 信号通路来抑制IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表达,且证实了其可上调VEGF蛋白的表达,从而促进血管内皮细胞新生,减轻炎性反应,加速创面组织的恢复,从而缩短愈合时间。以上研究表明,加味生肌玉红膏对于肛瘘术后创面的恢复具有良好作用。然而加味生肌玉红膏是否可通过其他作用机制促进创面愈合,需在以后的研究中进行更深入的探讨。