温肺降浊方对血管性痴呆模型大鼠ERK1/2信号通路相关蛋白的影响

宋晨曦,张 鼎,胡芷涵,姜明贺,李方存,胡跃强

(1.广西中医药大学,广西 南宁 530001;2.上海中医药大学,上海 201203;3.广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023)

血管性痴呆(Vascular dementia,VaD)是痴呆的常见类型之一,是由缺血性或出血性脑血管疾病引起低血流灌注导致的一种痴呆类型[1]。其临床表现以认知障碍为主,伴随运动异常、行为症状以及自主神经功能障碍等[2-4]。VaD的形成因素较为复杂,病因病机尚未可知[5]。多数学者指出,炎症因子、神经递质、氧化应激、细胞自噬等共同发挥作用导致了VaD的发生[6-9]。

《素问·宣明五气》曰：“心藏神,肺藏魄,肝藏魂,脾藏意,肾藏志。是谓五脏所藏。”五脏中任何一脏的功能失调,都会引起痴呆的发生。故历代医家基于藏象学说的系统理论,运用中医学整体观念和辨证论治的基本特点,从不同角度以不同方药来论治痴呆,为后世预防和治疗痴呆积累了大量宝贵的临床经验。鉴于VaD病理机制的复杂性与其所致多个脏器同病、多种危险因素并存的病理特点和中医防病、治病的理论体系相符,故中医在治疗VaD上有着明显的优势,而中药因其具有多成分、多途径、多靶点的系统优势,对于VaD的预防和治疗也有着重要的意义[10-11]。本研究基于ERK1/2信号通路,通过探讨温肺降浊方是否抑制Calpain、Bad蛋白表达,上调Bcl-xl蛋白表达量,从而发挥治疗血管性痴呆的药效作用,以期为中医药预防和治疗VaD提供新的思路和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康级成年雄性SD大鼠(n=30)购自于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物质量合格证号SCXK(湘)2019-0004,饲养于广西中医药大学科学实验中心动物房,所有动物常规护理,自由饮食,室温保持在(23.0±3.0)℃,湿度保持在(45.0±10.0)%,间隔3 d测量大鼠体重并记录。本研究经广西中医药大学科学实验中心动物伦理委员会批准;伦理批号DW20230425-105。

1.1.2 药物与试剂：温肺降浊方由制附子20 g(先煎),党参15 g,干姜、田七、酒大黄各10 g,炙甘草6 g组成。所有药物购买于广西中医药大学第一附属医院门诊中药房,本方分2 次煎煮,取汁200 ml,加热浓缩至含有原药材1.5 g/ml。苏木色精,Solarbio,批号 H8070;伊红Y(水溶),Solarbio,批号 E8090;无水乙醇、二甲苯,国药集团,批号10009218、10023418;中性树胶,国药集团,批号10004160;彩虹180广谱蛋白Marker(11-180 KD),Solarbio,批号PR1910;ERK1/2抗体、Calpain抗体、Bad抗体、Bcl-xl抗体,英国Abcam,批号分别为ab184699、ab108400、ab32445、ab32370。

1.1.3 实验仪器：全波长酶标仪系统,美国赛默飞世尔科技;正置显微镜,奥林巴斯BX53型生物显微镜等。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立：适应性喂养大鼠2周,体重(250±30) g。大鼠通过永久性双侧颈总动脉闭塞(2 VO)建立VaD大鼠模型。具体方法[12]：用40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔内麻醉大鼠,经颈部正中切口暴露双侧颈总动脉,轻轻分离双侧颈总动脉和迷走神经,用6-0 号丝线结扎双侧血管。假手术组只暴露动脉不进行结扎。整个手术过程操作轻柔,减少触碰迷走神经,术后用加热毯维持大鼠体温。

1.2.2 分组与给药：随机分为五组,假手术组、模型组、温肺降浊方低、中、高剂量组(n=3)。模型组和假手术组予以等体积蒸馏水灌胃,温肺降浊方低、中、高剂量组分别以1.5 g/kg药物浓度,灌胃1.5、3、6 ml,持续8周。末次给药后,各组大鼠禁食禁水24 h,1%戊巴比妥钠腹腔过量麻醉。各组分别取3只进行心脏灌注包埋,其余3只立刻断头取脑剥离海马组织,放入冻存管,-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 Morris水迷宫实验检测大鼠行为学：正式实验前进行为期2 d的大鼠游泳寻找逃生平台训练,依次从第1～4 象限指定点面向池壁放入水迷宫中,于60 s内成功停留站台,即完成实验;若60 s未成功找到站台,人工引导停留10 s,第1～2天为训练实验,后3 d记录逃避潜伏期数据,以均数来评估大鼠空间记忆能力。

1.2.4 HE染色观察大鼠海马组织形态：各组大鼠干预完成后,取材,固定,脱水后常规蜡块包埋,取出包埋好的组织蜡块,冰冻切片机切片4 μm左右。进行HE染色后脱水、透明、中性树胶封片,显微镜下观察并采集图像。

1.2.5 免疫组化法检测大鼠海马组织中细胞外信号调节激酶(Extracellular-signal regulated kinase,ERK)1/2、Bcl-xl、Bad蛋白表达：组织切片,梯度酒精脱水、透明,抗原修复,室温山羊血清封闭30 min,继续加入ERK1/2(1∶100)、Bcl-xl(1∶100)、Bad(1∶100)孵育,4 ℃湿盒避光孵育过夜。分别滴加荧光标记物,湿盒继续室温孵育1 h,滴加DAPI避光核染,抗荧光淬灭剂封片,倒置荧光显微镜采集图片、数据分析。

1.2.6 RT-qPCR法检测大鼠海马组织中ERK1/2、Calpain、Bad、Bcl-xl mRNA表达量：总RNA严格按照Trizol试剂盒试剂的说明提取,微量分光光度计测定OD值,计算RNA的纯度和浓度。将总RNA逆转录为cDNA,反应条件：42 ℃、2 min,50 ℃、15 min,85 ℃、5 s,4 ℃、10 min,1 个循环。扩增程序分为两步：95 ℃预变性10 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火延伸45 s。以GAPDH为内参,2-ΔΔCt法计算最终mRNA的相对表达量。PCR引物由南宁捷尼斯生物有限公司合成,引物序列见表1。

表1 各基因PCR相关引物序列

1.2.7 Western blot检测大鼠海马组织中ERK1/2、Calpain、Bad、Bcl-xl蛋白表达：从-80 ℃冰箱取出脑组织,剪出一部分组织放入装有钢珠的1.5 ml的EP管中,自动制冷匀浆机匀浆,加RIPA裂解液,加入PMSF蛋白酶抑制剂,BCA蛋白检测试剂盒进行定量分析。根据分子量制备相应分离胶,通过电泳、转膜、5%BSA封闭,TBST洗膜,一抗稀释比例：ERK1/2(1∶2000)、Calpain(1∶2000)、Bad(1∶2000)、Bcl-xl(1∶2000)孵育,4 ℃过夜;TBST洗膜3次,每次10 min,稀释二抗比例为(1∶5000),将PVDF膜放置于二抗中,37 ℃摇床孵育1.5 h,TBST洗膜,超敏ECL显色后曝光,以GAPDH为内参,计算目的蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠认知水平的比较 见表2。术后4周,模型组和各干预组大鼠之间逃避潜伏期较假手术组明显延长(P<0.05),而穿越平台次数较假手术组明显缩短,差异具有统计学意义(P<0.05),模型组和各干预组之间差异无统计学意义(P>0.05)。术后8周,模型组和各干预组大鼠逃避潜伏期较假手术组明显延长(P<0.05),穿越平台次数较假手术组明显缩短(P<0.05);和模型组比较,温肺降浊方低剂量组、温肺降浊方中剂量组逃避潜伏期和穿越平台次数差异无统计学意义(P>0.05),温肺降浊方高剂量组逃避潜伏期明显缩短,穿越平台次数明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠Morris水迷宫测试认知能力比较

2.2 各组大鼠海马组织病理学变化情况 假手术组大鼠海马区细胞排列紧凑,形态规整,数量较多;模型组大鼠海马区细胞排列散乱,形态极其不规则,细胞间质染色稀疏,出现部分水肿和细胞核缩小;各剂量中药组大鼠海马区神经元数量增加,以温肺降浊方高剂量组改善最为明显(图1)。

A：假手术组;B：模型组;C：温肺降浊方低剂量组;D：温肺降浊方中剂量组;E：温肺降浊方高剂量组

2.3 各组大鼠海马组织中ERK1/2、Bcl-xl、Bad的阳性蛋白表达情况比较 见表3(图2)。与假手术组相比,模型组大鼠海马组织ERK1/2、Bad阳性蛋白表达量升高(P<0.05),Bcl-xl蛋白表达量下降(P<0.05);和模型组相比,温肺降浊方中剂量组、温肺降浊方高剂量组ERK1/2、Bad阳性蛋白表达量下降(P<0.05),Bcl-xl蛋白表达量升高(P<0.05),其中以温肺降浊方高剂量组差异最为显著。

A：假手术组;B：模型组;C：温肺降浊方低剂量组;D：温肺降浊方中剂量组;E：温肺降浊方高剂量组

表3 各组大鼠海马组织中ERK1/2、Bcl-xl、Bad阳性蛋白表达比较

2.4 各组大鼠海马组织中ERK1/2、Calpain、Bad和Bcl-xl mRNA表达比较 见表4。与假手术组相比,模型组大鼠海马组织中mRNA的相对表达量出现不同程度的上调或下调,其中,ERK1/2、Calpain、Bad表达上升(P<0.05);Bcl-xl表达下降(P<0.05)。使用温肺降浊方各剂量组进行干预后,ERK1/2、Calpain、Bad表达下降(P<0.05);Bcl-xl表达上升(P<0.05)。

表4 各组大鼠海马组织中各项指标mRNA相对表达量比较

2.5 各组大鼠海马组织中ERK1/2、Calpain、Bad和Bcl-xl蛋白表达情况 见表5(图3)。与假手术组比较,模型组大鼠海马组织中ERK1/2、Calpain和Bad蛋白表达升高,Bcl-xl蛋白的表达量降低(P<0.05);与模型组比较,各剂量中药组大鼠海马组织中ERK1/2、Calpain和Bad蛋白表达降低,Bcl-xl蛋白的表达量升高(P<0.05)。

图3 各组大鼠海马组织中蛋白相对表达量印迹图

表5 各组大鼠海马组织中蛋白相对表达量比较

3 讨 论

血管性痴呆在中医学归属于“痴呆”“呆病”等范畴,其发病机制为痰、虚、瘀等诸多因素相互影响,病位在脑髓,但以肾虚为本[13],治疗原则以补虚泻实为主[14]。肺与血管性痴呆的联系主要与肺主气、司呼吸的生理功能有关[15]。若肺宣发、肃降功能失常,则清气不能宣发以滋养脑窍,浊气不能肃降而上扰清窍,可导致痴呆的发生[16]。本研究团队基于大量的前期研究基础提出,以“肺脏辨治痴呆”的主要思想,认为肺金失养是构成VaD发病过程中的关键因素。《灵枢》中记载：“肺气衰,魄离,故言善误”[17]。这也提示我们肺气虚衰可能是VaD疾病早期的病因之一,故治疗上须以宣通肺金之功,增强温煦温化之效为主。因此,温肺降浊方是治疗VaD的关键临床验方。方中制附子和党参共用,温阳行气,补益上、中二焦;干姜资助肺精,可助附子温阳;田七活血化瘀,运化周身血脉;大黄荡肠降浊,除陈生新;炙甘草调和诸药,缓急补中。诸药合用,温补同施,走泻并用,升降平衡。前期基础研究提示,本方可以上调或下调线粒体相关蛋白的表达,减少神经元凋亡,改善海马区突触损伤,从而提升大鼠的学习记忆能力。

ERK是MAPK家族中的亚家族,是MEK的唯一下游底物[18],由ERK1激酶和ERK2激酶组成[19],可以被多种因素激活,参与到细胞凋亡和增殖等过程中来[20]。ERK1/2通路可通过增强Bad表达、活化Calpain介导等方式启动细胞内源性的凋亡途径。Calpain被活化后能产生较强的破坏作用,可以裂解Bcl-xl,使其与Bad结合的功能丧失,导致游离的Bad增多,进而引起细胞凋亡[21]。同时,Bad又是Bcl-2家族中的重要成员,通过形成线粒体外膜通透性(MOMP)复合物来启动细胞凋亡[22]。此外,钙依赖性半胱氨酸中性蛋白酶Calpain,具有强烈的破坏作用,其活化后可裂解细胞结构,破坏溶酶体膜、导致细胞溶解坏死,也可裂解Bcl-xl、使其丧失与Bad结合的能力,导致游离Bad增多、Caspases蛋白活化,进而引起细胞发生凋亡[23-25]。

本次研究显示,成模后大鼠海马组织ERK1/2、Calpain、Bad蛋白表达升高,Bcl-xl表达下调;而经过温肺降浊方干预后ERK1/2、Calpain、Bad蛋白表达降低,Bcl-xl表达上升。此外,温肺降浊方高剂量组的表达更加显著。综上所述,温肺降浊方可能是通过促进VaD大鼠脑组织ERK1/2通路激活,从而抑制ERK1/2、Calpain、Bad蛋白的表达,上调Bcl-xl蛋白,进一步改善VaD大鼠的学习和记忆能力。