半夏泻心汤对功能性消化不良大鼠抑郁状态及促肾上腺皮质激素释放因子相关通路的影响

耿 琦,李敬伟,凌江红,蒋 健

(上海中医药大学附属曙光医院消化内科,上海 200021)

功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)是消化系统常见的一种功能性胃肠病,以胃和十二指肠功能紊乱引起的餐后饱胀、早饱感、上腹痛或上腹烧灼感等症状为主[1-3],是中医治疗的优势病种。随着现代社会生活压力的与日俱增,伴有焦虑、抑郁等精神障碍的FD患者亦日趋增多,除促动力外,抗抑郁在FD的治疗中同样具有重要的作用。临床研究亦证实促动力联合抗抑郁是FD的优选治疗方案[4-6]。但是,长期服用西药大多存在不良反应较多、易耐药、易产生依赖性等缺点,中医中药则可发挥一定的优势[7]。

半夏泻心汤是《伤寒论》的经典名方,现代多项临床研究表明本方对FD具有较好的疗效[8-11]。前期研究亦证实了半夏泻心汤在改善FD餐后饱胀不适和早饱症状的同时,还具有抗抑郁的作用[12-13]。本研究通过观察半夏泻心汤对FD大鼠抑郁状态及促肾上腺皮质激素释放因子(Corticotropin releasing factor,CRF)及其相关受体CRF-R1、CRF-R2的影响,探讨其抗抑郁的作用及其相关机制,旨在为本方治疗FD提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：选用Wistar大鼠,雄雌随机,SPF级,48只,7周龄,体重(220±20) g,购自上海杰思捷实验动物有限公司,动物使用许可证号：SCXK(沪)2018-0004,合格证号：20180004038434。饲养于上海大学动物实验中心,予标准饲料及饮用水,室温20～23 ℃,湿度40%～70%,12 h昼夜交替,动物自由进食和饮水。本研究获得上海中医药大学动物伦理委员会批准(伦理号 PZSHUTCM200703021)。

1.1.2 药物与试剂：半夏泻心汤饮片每剂含制半夏、黄芩、大枣各12 g,干姜、人参片、炙甘草各9 g,黄连6 g,购自上海中医药大学附属曙光医院中草药房。盐酸氟西汀胶囊(国药准字J20130010),每粒20 mg,购自上海中医药大学附属曙光医院西药房。石蜡,leica(39601095);二甲苯,泰坦(1018114);乙醇,泰坦(1101143);树胶,BBI(E675007);苏木素/伊红染色试剂盒,Thremo(7211);CRF抗体(Invitrogen,PA5-102356);CRF-R1抗体(Invitrogen,PA5-27121);CRF-R2抗体(Bioss,BS6620R);兔二抗(Abcam,M21002F)等。

1.1.3 实验仪器：正置显微镜,leica(DMT50);石蜡切片机,leica(RM2076);纯水仪,锐思捷(Unique-R10);酶标仪(Thermo,MuLTiSKANeMK3);微量移液器(Eppendrof,3120000.216);涡旋混合器(麒麟贝尔,XW-80A);离心机(中佳,SC-3610);超微量核酸测定仪(Thermo,Nanodrop one);RT-qPCR仪(伯乐,CFX Connect);掌上离心机(SCILOGEX,D1008U);电转仪(北京六一仪器厂,DYCZ-40);全自动化学发光图像分析系统(Tanon,Tanon-4200);GEL image system(Tanon,Tanon-1000)等。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立：48只大鼠随机分为空白组、模型组、氟西汀组、半夏泻心汤低剂量组、半夏泻心汤中剂量组、半夏泻心汤高剂量组,共六组,每组8只。适应性饲养7 d,第8天起除空白组外,其余五组用纱布包裹止血钳轻度钳夹鼠尾后1/3处,立即放开,每次30 min,2次/d;每周二、四、六禁食,余日给足量饲料,持续21 d,若有抓伤,予碘伏消毒伤口,以防感染。造模后大鼠体重下降、糖水偏好度及旷场实验移动总距离和直立次数明显下降,且与空白组比较具有统计学差异提示造模成功。

1.2.2 分组与给药：造模成功后,每组大鼠每日按1 ml/100 g体重灌胃,1次/d,持续14 d。半夏泻心汤低、中、高剂量组根据《药理实验方法学》“人和动物间按体表面积折算等效剂量”计算得出给药剂量,并扩大2倍灌胃给药,半夏泻心汤低剂量组(0.62 g/ml)、半夏泻心汤中剂量组(1.24 g/ml)、半夏泻心汤高剂量组(2.48 g/ml);氟西汀组(2 mg/kg);空白组和模型组每日均以同等容积的蒸馏水灌胃。

1.2.3 一般状态观察：每日8：00测量各组大鼠体重,并观察各组大鼠的精神状态、毛发光泽度、活动范围、摄食量及排便情况。

1.2.4 糖水偏好实验：分别于给药前和给药后进行1%糖水偏好实验。分别采用1%的蔗糖水溶液和蒸馏水作为实验饮水,在训练中,大鼠在前24 h每笼放入两瓶1%(W/V)的蔗糖溶液(即1 g蔗糖溶解于蒸馏水后定容至100 ml),紧接着24 h将其中的一瓶换成纯水,适应结束后,禁食禁水24 h,之后12 h的基线测试开始进行。在测试中,一瓶为1%(W/V)的蔗糖溶液,另一瓶为纯水,禁食,12 h后,取走两瓶并称重,记录大鼠的总液体消耗,糖水消耗和纯水消耗。糖水偏好度=蔗糖水消耗/(蔗糖水消耗+正常水消耗)×100%。

1.2.5 旷场实验：分别于给药前、给药结束后进行旷场活动行为学测试。将大鼠放置于敞箱底部中心方格内,观察大鼠移动总距离和直立(大鼠的两前爪腾空或者是两前爪攀附墙壁方可记录)的次数。测定5 min内大鼠移动总距离和直立的次数。每只大鼠测试前均用20%乙醇清除旷场实验箱的残留气味。

1.2.6 HE染色观察大鼠胃窦组织基本形态：糖水偏好、旷场实验结束后,用10%水合氯醛麻醉大鼠,剖腹取胃,剪取胃窦组织,经脱水、石蜡、包埋、切片(5 μm)、HE染色、封固后制成组织切片,置于光学显微镜下观察,并显微照相。

1.2.7 RT-qPCR法检测大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1、CRF-R2的mRNA表达水平：取大鼠适量下丘脑组织,采用Trizol法提取总RNA后进行反转录,测定CRF、CRF-R1、CRF-R2的相对表达量。反应条件依次为：95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s循环40次,60 ℃逐渐升温至95 ℃,每5 s升高0.5 ℃,循环71次。每个样本重复测量3次,采用ΔΔCt值方法,ΔCt=目的基因Ct值-GAPDH Ct值,ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组,目的基因相对表达倍数=2-ΔΔCt。引物序列见表1。

表1 CRF、CRF-R1、CRF-R2 mRNA引物序列

1.2.8 Western blot法检测大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1、CRF-R2的蛋白表达：取大鼠适量下丘脑组织,加入RIPA裂解液,低温匀浆,4 ℃ 12000 r/min离心,取上清。BCA法测定蛋白浓度,配置10%SDS-PAGE分离胶、5%SDS-PAGE浓缩胶。依次进行上样、电泳、转膜、用5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1 h后,分别加入一抗CRF(1∶2000)、CRF-R1(1∶1000)、CRF-R2(1∶1000),孵育过夜,洗膜3次,每次10 min,加入对应的鼠二抗(1∶3000)、兔二抗(1∶3000),室温孵育1 h,洗膜3次,每次10 min,曝光显影,拍照,保存图像,采用GEL Image图像分析系统对目的条带灰度进行分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件进行统计分析。所有统计数据均采用双侧检验,计量资料采用均数±标准差描述,前后重复测量资料及多组计数资料间的两两比较比较均采用广义估计方程;P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状态比较 给药前,除空白组外,其他各组大鼠活动增多,暴躁易怒,不容易抓取,经常发生笼内互相撕咬的情况,皮毛凌乱,发黄无光泽且不顺滑,饮食饮水量减少,粪便较为干燥。给药后,氟西汀组、半夏泻心汤低、中、高剂量组精神状态逐渐好转,毛发逐渐顺滑有光泽,性情趋于温顺,饮食饮水量增加,粪便基本正常;模型组大鼠仍然暴躁易怒,皮毛凌乱,发黄无光泽。

2.2 各组大鼠给药前后体重比较 见表2。与空白组比较,模型组大鼠给药后体重明显降低(P<0.01);与模型组比较,氟西汀组、半夏泻心汤低、中、高各剂量组大鼠的体重均明显增加(P<0.05)。

表2 各组大鼠给药前后体重比较(g)

2.3 各组大鼠给药前后糖水偏好度比较 见表3。给药前,与空白组比较,模型组、氟西汀组、半夏泻心汤低、中、高各剂量组大鼠糖水偏好度均明显下降(P<0.01)。给药后,与空白组比较,模型组大鼠糖水偏好度明显下降(P<0.01);与模型组比较,氟西汀组、半夏泻心汤低、中、高各剂量组大鼠的糖水偏好度均明显提高(P<0.01);与氟西汀组比较,半夏泻心汤低、中、高各剂量组虽有所提高,但差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠给药前后糖水偏好度比较(%)

2.4 各组大鼠给药前后旷场实验比较 见表4。给药前,与空白组比较,模型组、氟西汀组、半夏泻心汤低、中、高各剂量组大鼠旷场移动总距离均明显减少(P<0.01),模型组大鼠旷场直立次数减少(P<0.05),氟西汀组、半夏泻心汤低、中、高各剂量组大鼠旷场实验直立次数亦低于空白组,但差异无统计学意义(P>0.05)。给药后,与空白组比较,模型组大鼠旷场移动总距离和直立次数均明显减少(P<0.01);与模型组比较,氟西汀组、半夏泻心汤低、中、高各剂量组大鼠旷场移动总距离和直立次数均明显增加(P<0.05);与氟西汀组比较,半夏泻心汤低、中、高各剂量组大鼠旷场移动总距离和直立次数差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 各组大鼠给药前后旷场实验比较

2.5 各组大鼠胃窦组织基本形态比较 见图1。经HE染色后观察各组大鼠胃窦组织基本形态,结果发现各组大鼠胃窦组织结构基本完整,未见变性、坏死、炎性浸润等明显器质性病变。

A：空白组;B：模型组;C：氟西汀组;D：半夏泻心汤低剂量组;E：半夏泻心汤中剂量组;F：半夏泻心汤高剂量组

2.6 各组大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1、CRF-R2 mRNA相对表达量比较 见表5。与空白组比较,模型组FD大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1 mRNA表达升高(P<0.01),CRF-R2 mRNA表达降低(P<0.01)。与模型组比较,氟西汀组、半夏泻心汤低、中、高各剂量组FD大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1 mRNA的表达量均明显降低(P<0.01),CRF-R2 mRNA的表达量均明显升高(P<0.01)。

表5 各组大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1、CRF-R2 mRNA相对表达量比较

2.7 各组大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白相对表达量比较 见表6(图2)。与空白组比较,模型组FD大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1蛋白表达升高(P<0.01),CRF-R2蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组比较,氟西汀组、半夏泻心汤高剂量组FD大鼠下丘脑中CRF蛋白表达均明显降低(P<0.01),氟西汀组、半夏泻心汤低、中、高各剂量组FD大鼠下丘脑中CRF-R1蛋白表达均明显降低(P<0.01),氟西汀组、半夏泻心汤低、中、高各剂量组FD大鼠下丘脑中CRF-R2蛋白表达均升高(P<0.05)。

图2 各组大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白表达

表6 各组大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白相对表达量比较

3 讨 论

FD是一种身心疾病,与精神因素关系密切[14]。中医学多将本病归属于“胃痞”范畴,其病位在胃,与肝、脾二脏关系密切;情志不畅、饮食不节是本病的主要病因;情志不畅、肝气郁结,横逆乘脾犯胃,加之饮食不节、脾胃失调,升降失常,中焦枢机不利,气机郁滞不畅,是主要病机[15]。因此调和肝脾,恢复中焦气机升降,乃是本病的主要治疗法则。半夏泻心汤是《伤寒论》的经典名方,主治心下痞证(即胃痞)。《内经》云：“辛走气,辛以散之”,散痞者,必以辛为助,方中以辛温、辛热之半夏、干姜消痞散结、和胃降逆,以分阴而行阳;《内经》又云：“苦先入心,以苦泄之”,故泻心者,必以苦为主,是以黄连、黄芩苦寒,泻热消痞,以降阳而升阴;成无己《注解伤寒论》云：“阴阳不交曰痞,上下不能为满。欲通上下,交阴阳,必和其中”,人参、大枣甘温,补脾和中益气;甘草调和诸药。全方通上下、交阴阳、和其中,可调畅中焦气机,恢复气机升降,既可消痞还可疏郁,与FD病机相契合。

本研究采用不规则喂养联合夹尾刺激的双因素造模方法制备了FD模型[16]。结果显示,各造模组大鼠饮食饮水量明显减少,并且出现粪便干燥的表现,而胃窦黏膜组织病理切片却未见明显器质性病变。另外,各造模组大鼠出现活动增多,暴躁易怒,不容易抓取,经常发生笼内互相撕咬等情况;通过糖水偏好和旷场实验的测试,各造模组大鼠愉悦感缺失、运动度和对陌生空间的探索能力下降,提示大鼠陷入了抑郁状态。以上表明通过不规则喂养联合夹尾刺激法制备的FD大鼠模型成功。

糖水偏好和旷场实验均是经典的评价实验动物抑郁、焦虑样行为和相关性快感缺乏症的方法[17-18]。本研究发现,半夏泻心汤低、中、高各剂量组FD大鼠的糖水偏好度、移动总距离和直立次数均较模型组增加,提示其能改善大鼠的愉悦感、活动度,以及对新异环境的好奇程度和探索能力。同时经半夏泻心汤治疗后的FD大鼠精神状态亦逐渐好转,性情趋于温顺,皮毛顺滑光泽。以上均表明半夏泻心汤能有效改善FD大鼠抑郁状态,具有一定的抗抑郁作用。

CRF是一种含有41个氨基酸的神经多肽,广泛表达于中枢神经系统[19],同时在胃肠道中也有表达[20]。CRF主要有两个亚型,即CRF-R1和CRF-R2。CRF与CRF-R1受体具有高度的亲和力,在垂体前叶、海马、大脑皮质和杏仁核等与应激和情感调节相关的脑区与CRF重叠分布;CRF与CRF-R2受体的亲和力则较低,多位于离散的脑区,其具有抵消CRF-R1刺激引起的应激反应的作用[21]。大量临床及实验研究表明,CRF是“脑-肠”轴在心理应激反应时的关键调节因子[22],其与CRF-R1和CRF-R2受体的平衡失调在精神压力导致的多种功能性胃肠病中扮演了重要的角色[23-24]。在健康人群中,CRF-R1和CRF-R2维持着动态平衡,而在肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)、FD等功能性胃肠病中发现CRF-R1和CRF-R2处于失衡状态。有学者研究发现CRF-R1和CRF-R2的失衡介导了IBS的内脏高敏状态,并提出了CRF-R1和CRF-R2信号的平衡方向决定了IBS结肠的敏感性和蠕动力[25]。碘乙酰胺诱导的FD模型大鼠可引起抑郁样行为,其下丘脑中CRF表达明显升高,用CRF-R1拮抗剂则可逆转大鼠抑郁样行为,提示大鼠抑郁样行为可能与CRF-R1表达过度升高有关[26]。本研究显示,FD大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1 mRNA的表达水平和蛋白表达水平均较空白对照组升高,而CRF-R2 mRNA和蛋白表达水平均降低,提示FD大鼠存在CRF-R1和CRF-R2的失衡状态,其抑郁的发生可能与CRF、CRF-R1升高和CRF-R2降低有关。半夏泻心汤可通过下调大鼠下丘脑中CRF、CRF-R1 mRNA和蛋白的表达水平,同时上调CRF-R2 mRNA和蛋白的表达水平,恢复CRF-R1和CRF-R2的平衡状态,发挥抗抑郁的作用。

综上所述,半夏泻心汤可通过调控CRF通路,恢复CRF-R1和CRF-R2的平衡状态,发挥抗抑郁作用,关于其具体作用靶点有待进一步研究。