番茄疫霉根腐病菌拮抗细菌HP8-1的鉴定及生物防治潜力

王艺茹,潘培培,沈虎生,张林林,王润东,何梦菡,申顺善

(河南农业大学植物保护学院,河南 郑州 450046)

近年来,随着蔬菜产业的发展,番茄种植面积不断增加和连年种植,导致土壤病原菌的积累等连作障碍问题严重。番茄疫霉根腐病是由辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)和寄生疫霉(P.parasitica)等引起的一种毁灭性土传病害,从苗期到成株期均可发生,主要危害根部,也可危害番茄其他部位,严重时引起整株枯死,在设施生产中发病严重,甚至毁种绝收,严重威胁番茄生产[1-2]。目前,生产上由于缺乏高抗品种,防治番茄疫霉根腐病主要采用化学药剂,而长期使用化学药剂易使病原菌产生耐药性,且对环境不友好,甚至对人畜造成安全隐患[3]。利用植物根际促生菌防治植物病害并促进植物生长,因其安全、环保、无残留等特点,已受到广泛关注[4-8]。西姆芽孢杆菌(Bacillussiamensis)FC12-05可显著抑制辣椒疫霉菌的菌丝生长和孢子萌发,对番茄疫霉根腐病的盆栽防治效果显著[9];贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ZF50对辣椒疫霉菌有较好的抑菌效果,在盆栽试验和田间试验中均对番茄疫霉根腐病具有较好的防治效果,同时对番茄幼苗具有促生作用[10];贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)Y4-39对辣椒疫霉菌具有抑制效果,其发酵液对辣椒疫病的防治效果达67.78%[11]。但是,目前在生产上应用的防治植物疫病的微生物制剂还很欠缺,需要继续筛选优良生物防治资源,研发高效微生物制剂。本研究从河南省潢川县吊兰(Chlorophytumcomosum)根系分离筛选获得一株具有较强拮抗活性的植物根际细菌HP8-1,探索其生物学功能和定殖能力,研究其对番茄疫霉根腐病的防治能力及其生物防治潜力,为番茄疫霉根腐病的生物防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物根际细菌HP8-1为从河南省横川县吊兰根系分离筛选获得,将HP8-1在含利福平的培养基上进行诱导培养,逐步提高利福平质量浓度,最终得到稳定抗利福平(100 mg·L-1)的菌株并保存备用;供试辣椒疫霉菌(P.capsici)是由河南农业大学植物病害生物防治研究室分离、鉴定并保存。供试番茄品种‘粉都金冠王’为河南豫艺种业科技发展有限公司提供。供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基、胰酪大豆胨琼脂(tryptic soy agar, TSA)培养基和V8琼脂(vegetable juice agar,V8A)培养基,培养基配方参考潘培培等[12]。

1.2 方法

1.2.1 HP8-1的鉴定 形态特征和生理生化特性主要参考《常见细菌系统鉴定手册》[13],16S rRNA序列同源性分析主要参考张婉菊等[14]的方法,扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果在NCBI中进行BLAST比对分析,并利用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

1.2.3 HP8-1菌悬液的配制 在TSA培养基平板上培养72 h后,刮取菌落用无菌0.1 mol·L-1MgSO4溶液配制成108CFU·mL-1的菌悬液。

1.2.4 疫霉菌孢子悬浮液的配制 疫霉菌的孢子悬浮液的配制参照潘培培等[12]的方法,获得104孢子·mL-1的游动孢子悬浮液。

1.2.5 HP8-1在番茄根际定殖量测定 采用稀释涂布平板法测定番茄根际HP8-1的定殖量。选取2～3片真叶大小的健壮番茄苗移栽,移栽花盆直径为 90 mm,将100 mL的HP8-1菌悬液灌注到番茄根际土壤,然后沿着花盆壁接种5 mL的疫霉菌孢子悬浮液,置于温室培育。每个处理3个重复,每个重复18株。处理后第1天开始每隔3 d采集番茄根系和根际土壤测定HP8-1的定殖量。即:称取清洗干净的1 g番茄根系进行研磨,然后用无菌0.1 mol·L-1MgSO4溶液稀释获得10-3～10-4根系稀释液;称取1 g番茄根际土壤,用无菌0.1 mol·L-1MgSO4溶液稀释获得10-5～10-6根际土壤稀释液,吸取0.1 mL根系和根际土壤稀释液,分别均匀涂布于含100 mg·L-1利福平的TSA平板上,28 ℃恒温培养2 d后调查菌落数,推算出HP8-1的定殖量。

1.2.6 HP8-1对番茄疫霉根腐病的防治效果和对番茄的促生效果测定 HP8-1对番茄疫霉根腐病的防治效果和对番茄的促生效果测定采用盆栽试验。HP8-1和疫霉菌处理方法同1.2.5,每个处理3个重复,每个重复18株。试验设清水对照(CK)、HP8-1处理(HP8-1)、疫霉菌处理(Pc)和疫霉菌+HP8-1处理(Pc+HP8-1)。处理后第10天调查发病情况,计算病情指数和防治效果。调查番茄疫霉根腐病的病情分级标准参考KOZIK等[19]和毛爱军等[20]方法并略作修改,0级为没有症状;1级为根尖或侧根出现轻微褐变,叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫;2级为根部中度褐变,变色不穿透髓,叶片不可恢复性萎蔫,下部叶片偶有脱落;3级为所有的根表面布满棕色病变,髓变色,叶片明显萎蔫或落叶明显;4级为根系腐烂,地上部倒伏,植株死亡。另外,处理后在温室培育第10天调查番茄生育指标,并采用分光光度法测定叶绿素含量,采用TTC法测定根系活力[21]。

病情指数=∑(各级病株数×相应级数值)/(调查总株数×最高级代表值)×100

防治效果/%=(对照病情指数-处理病情指数)/ 对照病情指数×100

1.3 数据分析

利用Excel 2016 和SPSS 26.0 软件对试验数据进行处理分析,以最小显著差数法(LSD)分析各处理的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 HP8-1的鉴定和生物学功能

HP8-1在TSA培养基上形成米黄色、不规则形、半透明、边缘不整齐的菌落(图1)。HP8-1菌体为直杆状,周生鞭毛,革兰氏阳性,生长温度为4～50 ℃,耐盐度最高为NaCl质量分数4%,能利用蔗糖、葡萄糖、甘油、麦芽糖和甘露醇,不能利用半乳糖和单宁酸,淀粉水解、硝酸盐还原反应及V-P测定呈阳性,明胶液化、产H2S试验呈阴性(表1)。HP8-1的16S rRNA基因扩增序列全长1 492 bp,利用NCBI进行BLAST比对结果,与多粘类芽孢杆菌对应16S rRNA序列同源性达到99%。采用MEGA软件构建其系统发育树,与多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa(AB689757.1)聚在一个分支,支持率为100%(图2)。综上所述,结合形态学、生理生化特性及分子生物学鉴定结果, HP8-1为多粘类芽孢杆菌。HP8-1菌株的抑菌谱比较广,对多种植物病原菌具有较强的抑菌活性(图3)。另外,HP8-1菌株能够分解有机磷、蛋白、淀粉和纤维素,具有产生嗜铁素、葡聚糖酶和吲哚乙酸能力(图4)。

表1 HP8-1的形态特征和生理生化特性Table 1 Morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics of HP8-1

图1 HP8-1的菌落形态Fig.1 HP8-1 colony morphology

图2 基于16S rRNA序列构建的HP8-1系统发育树Fig.2 HP8-1 phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA sequence

图3 HP8-1对植物病原菌的抑菌活性Fig.3 Antifungal activity of HP8-1 against plant pathogens

图4 HP8-1的生物学功能Fig.4 Biological functions of HP8-1

2.2 HP8-1在番茄根际定殖量

HP8-1在番茄根系及根际土壤均具有稳定的定殖能力。在番茄根系,未接种疫霉菌条件下HP8-1在番茄根系的定殖量趋于减少,而在接种疫霉菌条件下,HP8-1在番茄根系的定殖量趋于增加,处理第1天,未接种疫霉菌的条件下HP8-1的定殖量为3.32×104CFU·g-1,高于接种疫霉菌条件下的HP8-1的定殖量,而到第10天,接种疫霉菌的条件下HP8-1的定殖量为7.48×104CFU·g-1,显著高于未接种疫霉菌条件下的HP8-1的定殖量(图5-A)。在番茄根际土壤,未接种疫霉菌和接种疫霉菌条件下HP8-1的定殖量均趋于增加,处理第1天和第4天,在未接种疫霉菌和接种疫霉菌条件下HP8-1的定殖量没有差异,而到第7天和第10天,接种疫霉菌条件下HP8-1的定殖量分别为5.88×106和7.67×106CFU·g-1,显著高于未接种疫霉菌条件下的HP8-1的定殖量(图5-B)。可见,HP8-1在番茄根系和根际土壤中具有稳定的定殖能力,在接种疫霉菌的条件下也能够稳定定殖在番茄根系和根际土壤。

A:根系;B:根际土壤。同组不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。下同。A: Root; B: Rhizosphere soil. Different lowercase letters in same group indicate significant difference at p<0.05. The same as below.

2.3 HP8-1对番茄疫霉根腐病防治效果

HP8-1处理显著抑制番茄疫霉根腐病的发生。接种疫霉菌处理(Pc)的番茄植株在接种疫霉菌后第6天开始表现下部叶片黄化脱落症状,第10天时叶片表现黄化萎蔫症状,根系有明显腐烂,病情指数达到75.00;而HP8-1处理(Pc+HP8-1)的番茄植株,接种疫霉菌第6天没有表现症状,第10天时根系部分褐变,病情指数为31.94,HP8-1处理对番茄疫霉根腐病的防治效果达到57.41%(表2,图6)。

表2 HP8-1对番茄疫霉根腐病的防治效果Table 2 The control effect of HP8-1 against Phytophthora root rot of tomato

图6 HP8-1对番茄疫霉根腐病的防治效果Fig.6 The control effect of HP8-1 againstPhytophthora root rot of tomato

2.4 HP8-1对番茄的促生效果

盆栽试验结果表明,在接种疫霉菌和未接种疫霉菌条件下HP8-1处理均显著促进番茄植株生长和根系发育。在未接种疫霉菌条件下,HP8-1处理(HP8-1)的番茄株高、茎粗、鲜质量和干质量分别比清水处理(CK)提高2.56 cm、0.74 mm、2.66 g、1.01 g,番茄叶绿素含量比对照增加1.155 mg·g-1;

在接种疫霉菌的条件下,HP8-1处理(Pc+HP8-1)的番茄株高、茎粗、鲜质量和干质量分别比对照处理(Pc)提高3.66 cm、0.37 mm、2.33 g、0.95 g,番茄叶绿素含量比对照增加0.673 mg·g-1(表3,图7)。在未接种疫霉菌条件下,HP8-1处理(HP8-1)的番茄根长、根鲜质量、根干质量和根体积比清水处理(CK)分别提高3.13 cm、0.64 g、0.09 g、0.73 cm3,根系活力比对照增加0.168 mg·g-1·h-1;在接种疫霉菌的条件下,HP8-1处理(Pc+HP8-1)的番茄根长、根鲜质量、根干质量和根体积比对照处理(Pc)分别提高3.3 cm、0.53 g、0.05 g、0.54 cm3,根系活力比对照增加0.154 mg·g-1·h-1(表4,图8)。HP8-1对番茄整体促生效果见图9。

表3 HP8-1对番茄植株生长的影响Table 3 Effect of HP8-1 on the growth of tomato

表4 HP8-1对番茄根系生长的影响Table 4 Effect of HP8-1 on root growth of tomato

图7 HP8-1对番茄叶绿素含量的影响Fig.7 Effect of HP8-1 on chlorophyll content of tomato

图8 HP8-1对番茄根系活力的影响Fig.8 Effect of HP8-1 on root activity of tomato

图9 HP8-1对番茄的促生效果Fig.9 Growth-promoting effect of HP8-1 on tomato

3 结论与讨论

多粘类芽孢杆菌属于类芽孢杆菌属,对环境无污染,对人畜无害,对植物不致病,兼具防病和促生作用,是具有潜力的生物防治资源[22-23]。现已发现,多粘类芽孢杆菌具有多种防病机制,对多种植物病害有较好的防治作用。如多粘类芽孢杆菌BRF-1菌悬液及无菌代谢产物对黄瓜和番茄枯萎病均具有防治效果[24];多粘类芽孢杆菌ZF197通过自身分泌抗菌活性物质对白菜茎基腐病起到较好的防治效果[25];多粘类芽孢杆菌HAAS05可促进植物产生内源激素,并在防御酶的共同作用下防治甘薯蔓割病[26];多粘类芽孢杆菌SeR8、BR20及SC09-21均可产生纤维素酶、蛋白酶、IAA和嗜铁素,分解磷酸钙,SeR8和BR20能防治小麦茎基腐病、小麦赤霉病和细菌性条斑病,SC09-21可促进辣椒生长并对辣椒疫病有显著的防治作用[27-28]。本研究结合形态学、生理生化特性及分子生物学鉴定结果,HP8-1为多粘类芽孢杆菌,具有产嗜铁素、产葡聚糖酶、分解纤维素、分解蛋白、产IAA等生物学功能,该菌株对番茄疫霉根腐病具有明显的防治效果,同时显著促进番茄生长。另外,HP8-1的抑菌谱比较广,对多种植物病原菌具有明显的抑菌活性。综上所述,HP8-1是很有潜力的生物防治资源,其具体的作用机制有待进一步探讨。

生防菌在植物根际有效定殖是其发挥作用的关键[29]。当生防菌在植物根际有效定殖后,可以提高植物对病原物的抗性并促进植物生长。如荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)PEF-5#18定殖于番茄根际土壤并扩展于番茄根系和茎内组织,从而有效防控尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.radicislycopersic)的侵染并促进番茄植株生长[30];马氏类芽孢杆菌(Paenibacillusmaysiensis)TL1在番茄果实中成功定殖,有效抑制由灰霉病菌引起的腐烂[31];蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)CLY07在南方红豆杉根际能长期稳定定殖,从而发挥极好的促生作用[32]。生防菌的根际定殖能力受到很多因素的影响,如生防菌本身的遗传特性、土壤微生物、土壤理化性质、根系分泌物等[33]。YUAN等[34]研究结果表明,接种植物病原菌能够改变植株根系分泌物组分招募更多有益微生物,提高植物的抗病作用。本研究结果表明,HP8-1菌株在番茄根系和根际土壤均稳定定殖,且在接种疫霉菌的条件下其定殖量增多,这可能是接种疫霉菌改变根系分泌物组分进而提高HP8-1的定殖量,它们之间的相关性有待于进一步分析。

综上所述,HP8-1菌株作为植物根际促生细菌,对番茄疫霉根腐病有较好的防治效果和显著促生作用,具有稳定的定殖能力,具备较大的研发应用潜力,其生物防治机制和应用技术有待于进一步探索。