同位素稀释高分辨气相色谱-高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中17种二噁英类化合物

王洪妮，张丽丽，俞斌，陈海华

（江苏全威检测有限公司，江苏常州 213164）

咪鲜胺作为一种低毒杀菌剂，被广泛用于防治蔬菜瓜果的炭疽病、叶斑病、枯萎病等[1-2]。目前市售的咪鲜胺原药大多是以2，4，6-三氯苯酚为原料，依次与1，2-二氯乙烷、丙胺、光气、咪唑等反应制得[3-4]。该合成路线中会伴随以含氯化合物作为前驱体经缩合反应生成的二噁英类副产物[5-6]，二噁英类化合物会通过咪鲜胺原药的生产和使用扩散到生态环境中，造成一定程度的污染。二噁英类化合物属于持久性有机污染物，被国际研究中心列为一级致癌物，具有不可逆的致癌、致畸、致突变毒性，其与呼吸毒性、皮肤毒性、肝毒性、生殖毒性、神经系统毒性和内分泌毒性等多种毒性作用[7-8]，对生态环境和人体健康产生较大危害，因此检测咪鲜胺原药中二噁英类化合物，对于加强持久性有机污染物防治，保护人类家园具有重要意义。

二噁英类化合物的检测方法主要有气相色谱-三重四极杆质谱法、气相色谱-串联质谱法、高分辨气相色谱-高分辨质谱法、酶诱导法、体外荧光素酶法、酶联免疫分析法等[9-12]，其中高分辨气相色谱-高分辨质谱法是国际上公认的最权威的二噁英类化合物检测方法，能精确地检测出二噁英类化合物的种类，并准确定量，是我国市场上出具检测报告的唯一方法[13]。目前我国二噁英检测主要集中在环境、食品领域，尚未有咪鲜胺原药中二噁英类污染物检测的相关报道。考虑到咪鲜胺农药应用的广泛性，以及二噁英类化合物超痕量检测的复杂性，笔者建立了一种同位素稀释高分辨气相色谱-高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中17 种二噁英类化合物。该方法实用性强，灵敏度高，特异性好，可为包括咪鲜胺原药在内的含氯有机农药中二噁英类化合物的检测提供技术参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高分辨气相色谱-高分辨双聚焦磁质谱联用仪：Thermo Trace 1310-DFS 型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

电子分析天平：YP10002 型，感量为0.01 g，上海越平科学仪器有限公司。

强磁力搅拌器：98-2 型，巩义市予华仪器有限责任公司。

旋转蒸发仪：YRE-201D型，巩义市予华仪器有限责任公司。

全自动氮空吹扫仪：YGC-16A 型，天津艾维欧科技发展有限公司。

微量注射器：10 μL-N 型，哈美顿(上海)实验器材有限公司。

二噁英类混合标准溶液Ⅰ：包含15 种同位素13C12标记的二噁英类化合物，溶剂为壬烷，各组分质量浓度见表1，美国剑桥CIL (同位素标准品)公司。

表1 二噁英类混合标准溶液信息Tab.1 Information of dioxin mixed standard solution

二噁英类混合标准溶液Ⅱ：包含2 种同位素13C12标记的二噁英类化合物，溶剂为壬烷，各组分质量浓度见表1，美国剑桥CIL (同位素标准品)公司。

二噁英类混合标准溶液Ⅲ：包含17种二噁英类化合物，溶剂为壬烷，各组分质量浓度见表1，美国剑桥CIL (同位素标准品)公司。

二噁英类混合标准溶液Ⅳ：包含17种二噁英类化合物，由二噁英类混合标准溶液Ⅲ稀释制得，溶剂为壬烷，各组分质量浓度见表1。

二噁英类混合标准溶液CS1～CS5：包含17 种二噁英类化合物和17 种同位素13C12标记的二噁英类化合物，溶剂为壬烷，各组分质量浓度见表1，美国剑桥CIL (同位素标准品)公司。

正己烷：农残级，上海星可高纯溶剂有限公司。

甲苯：农残级，麦吉睿珀(上海)生物科技有限公司。

二氯甲烷：农残级，上海星可高纯溶剂有限公司。

中性硅胶：60N型，日本关东化学株式会社。

活性炭硅胶：二噁英类化合物分析专用，日本关东化学株式会社。

无水硫酸钠：优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

咪鲜胺原药样品：市售。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 气相色谱仪

色谱柱：TR-Dioxin-5MS 型毛细管柱[60 m×0.25 mm，0.25 μm，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；进样口温度：280 ℃；载气：高纯氦气；载气流量：1 mL/min；进样方式：不分流进样；进样体积：1 μL；升温程序：初始温度为140 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升温至200 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持16 min，以5 ℃/min 的速率升温至235 ℃，保持7 min，以5 ℃/min 的速率升温至310 ℃，保持10 min。

1.2.2 高分辨双聚焦磁质谱仪

离子源：电子轰击(EI)；检测方式：选择离子监测(MID)；离子源温度：260 ℃；传输线温度：280 ℃；电子能量：45 eV；分辨率：大于10 000。

1.3 相对响应因子计算

分别取二噁英类混合标准溶液CS1～CS5，按照1.2仪器工作条件进行测定，由工作站软件Target Quan分析数据，参考GB 5009.205—2013《食品安全国家标准 食品中二噁英及其类似物毒性当量的测定》计算相对响应因子及其平均值，该相对响应因子的相对标准偏差应小于20%，否则需重新试验并计算。

1.4 实验方法

1.4.1 样品提取

称取10.00 g (精确至0.01 g)咪鲜胺原药样品于烧杯中，加入200 mL正己烷-二氯甲烷(体积比为5∶1)混合溶剂溶解，样品全部溶解后用微量注射器加入5 μL二噁英类混合标准溶液Ⅰ，再加入30 g酸化硅胶(由44 g 浓硫酸和56 g 中性硅胶配制而成，下同)，磁力搅拌2 h，用无水硫酸钠小柱过滤；烧杯中剩余的酸化硅胶加入50 mL 正己烷清洗，磁力搅拌30 min，用无水硫酸钠小柱过滤；重复清洗3 次，收集全部过滤液作为样品提取液，浓缩至2 mL左右待下一步净化。若酸化硅胶的颜色较深，则重复酸化硅胶提取过程，直至酸化硅胶为浅黄色。

1.4.2 样品净化

选用多层硅胶柱与活性炭硅胶柱组合方式净化。多层硅胶柱填料从下到上依次为4 g无水硫酸钠、3 g中性硅胶、5 g碱性硅胶(由40 mL质量浓度为50 g/L氢氧化钠溶液和98 g中性硅胶配制而成)、2 g中性硅胶、10 g 酸化硅胶、2 g 中性硅胶、4 g 无水硫酸钠。用40 mL 正己烷淋洗活化柱子后上样，用120 mL 正己烷淋洗多层硅胶柱，接收洗出液，浓缩后待活性炭硅胶柱净化。

活性炭硅胶柱填料为1 g活性炭硅胶，用40 mL正己烷清洗活化柱子后上样，依次用25 mL正己烷、40 mL正己烷-二氯甲烷(体积比为3∶1)混合溶剂淋洗柱子，弃去洗出液，翻转活性炭硅胶柱，用60 mL甲苯淋洗翻转后的活性炭硅胶柱，接收该甲苯洗出液，浓缩后用二氯甲烷定量转移至2 mL全回收自动进样瓶中，用高纯氮气吹除多余溶剂，浓缩至近干后，加入5 μL 二噁英类混合标准溶液Ⅱ和20 μL 壬烷，作为样品溶液。

1.4.3 样品测定

净化后的样品溶液按照1.2仪器工作条件测定，根据1.3计算的相对响应因子平均值，由工作站软件TargetQuan 分析数据，参考HJ 77.3—2008《固体废物 二噁英类的测定 同位素稀释高分辨气相色谱-高分辨质谱法》，以同位素稀释二级内标法定量计算17种2，3，7，8-氯代二噁英类化合物质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 提取方法选择和优化

二噁英类化合物常用的提取方法有索氏提取法、加速溶剂法、液液萃取法、酸化硅胶吸附法等[14]。咪鲜胺原药熔点(46.5～49.3 ℃)较低，不适宜采用索氏提取和加速溶剂提取方式提取；咪鲜胺原药微溶于水(25 ℃时在水中溶解度为34.4 mg/L)，也不适宜采用液液萃取方式提取。酸化硅胶可吸附多种离子或非离子性官能团化合物，如生物碱、糖脂、多环芳香族化合物及胺类物质等，且吸附容量大，不易造成过载，可有效吸附咪鲜胺化合物而不吸附二噁英类物质，从而达到分离提取二噁英类化合物的目的，方便快捷，成本低，故选择酸化硅胶吸附法提取样品。

2.2 提取溶剂选择

分别选择乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷及正己烷-二氯甲烷混合溶剂作为提取溶剂，考察不同溶剂溶解咪鲜胺原药后酸化硅胶的吸附效果。结果发现，正己烷-二氯甲烷混合溶剂提取效果最好，样品经乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷单一溶剂溶解后，酸化硅胶无法完全吸附咪鲜胺，上清液浓缩后会出现咪鲜胺化合物残留。进一步考察不同体积比的正己烷-二氯甲烷混合溶剂对酸化硅胶吸附效果的影响。结果发现，当正己烷与二氯甲烷的体积比为1∶1时，酸化硅胶无法完全吸附去除咪鲜胺，上清液浓缩后有咪鲜胺化合物残留；而当正己烷与二氯甲烷的体积比为10∶1时，无法完全溶解咪鲜胺原药。调整正己烷与二氯甲烷的体积比，同时综合考虑混合溶剂的毒性，在保证样品提取效果的基础上尽量减少二氯甲烷用量。结果表明，当正己烷与二氯甲烷的体积比为5∶1 时能完全溶解咪鲜胺原药，酸化硅胶可吸附全部咪鲜胺，上清液浓缩后没有咪鲜胺化合物残留，提取效果最好，故选择正己烷-二氯甲烷混合溶剂的体积比为5∶1。

2.3 色谱条件优化

选择赛默飞世尔科技(中国)有限公司生产的二噁英类化合物检测专用TR-Dioxin-5MS 型毛细管柱，固定相为5%苯基-95%甲基聚硅氧烷，柱长60 m。色谱条件参考HJ 77.3—2008 设定，升温程序、进样方式未作改变，进样口温度略有调整，结合GB 5009.205—2013，将进样口温度升高10 ℃，调整为280 ℃，确保样品气化完全，降低高氯代二噁英类化合物的损失，优化结果见1.2.1。

在优化的色谱条件下分别测定咪鲜胺原药和二噁英类混合标准溶液(CS3)，总离子流色谱图如图1所示。图1结果表明，该色谱柱抗干扰能力强，在高分辨率条件下，可实现17种二噁英类化合物的良好分离，样品基质不产生干扰。

图1 咪鲜胺原药和二噁英类混合标准溶液（CS3）总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of prochloraz and dioxin mixed standard solution（CS3）

2.4 质谱条件优化

质谱条件参考HJ 77.3—2008设定，并按该标准进行分辨率调节和质量校正，优化结果见1.2.2。

2.5 线性方程与方法检出限

在1.2仪器工作条件下，分别测定二噁英类混合标准溶液CS1～CS5，以二噁英类化合物质量浓度为横坐标，以二噁英类化合物两个监测离子色谱峰面积之和与对应的同位素13C12标记的二噁英类化合物两个监测离子峰面积之和的比值为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。

以正己烷-二氯甲烷混合溶剂(体积比为5∶1)为空白试剂，添加5 μL 二噁英类混合标准溶液Ⅳ，按1.4 实验方法重复测定7 次，计算测定值的标准偏差，以3倍标准偏差作为方法检出限[15]，根据称样质量换算成样品中的含量，以质量分数表示。

17种二噁英类化合物的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表2。由表2 可知，17种二噁英类化合物的质量浓度在对应范围内与色谱峰面积比值线性关系良好，相关系数为0.999 7～0.999 9。当称样量为10 g 时，咪鲜胺原药样品中二噁英类化合物的检出限为0.01～0.1 ng/kg，表明该方法灵敏度高，满足分析要求。

表2 17种二噁英类化合物质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及检出限Tab.2 Linear range，linear equation，correlation coefficient and detection limit of 17 dioxins

2.6 精密度试验

取同一批次咪鲜胺原药样品6份，按1.4实验方法进行测定，结果见表3。由表3 可知，测定结果的相对标准偏差为4.3%～13.6%，表明该方法精密度较高，满足分析要求。此外，咪鲜胺原药中二噁英类化合物测定结果呈现多氯代二苯并-对-二噁英比多氯代二苯并呋喃含量高的趋势，二噁英类化合物分布规律基本符合二噁英类化合物合成机理，即前驱物反应主要生成多氯代二苯并-对-二噁英[16-18]。

表3 精密度试验结果Tab.3 Results of precision test

2.7 加标回收试验

取咪鲜胺原药样品，分别添加低、高2个加标水平的17种二噁英类化合物混合标准溶液(由二噁英类混合标准溶液Ⅲ稀释制得，各组分添加质量分数见表4)，按照1.4 实验方法进行检测，每个加标水平平行测定6次，计算17种二噁英类化合物的回收率，结果列于表4。由表4可知，17种二噁英类化合物回收率为76.2%～115.8%，表明该方法准确度较高，满足分析要求。

表4 加标回收试验结果Tab.4 Results of recovery test

3 结语

建立了同位素稀释高分辨气相色谱-高分辨质谱法测定咪鲜胺原药中17 种二噁英类化合物含量的方法，通过优化提取方法，简化了样品处理操作步骤。该方法实用性强、灵敏度高、选择性好，可为包含咪鲜胺原药在内的含氯农药中二噁英类化合物的检测提供技术支持。