黄芩苷调节cAMP/PKA/CREB信号通路对湿疹大鼠皮肤屏障功能的影响

王首帆 徐宜厚 徐爱琴 朱立宏

摘要：目的 探討黄芩苷（BA）调节环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）/cAMP反应元件结合蛋白（CREB）通路对湿疹大鼠皮肤屏障功能的影响。方法 将SD大鼠随机分为对照组（NC组）、Model组、低剂量BA组（BA-L组，25 mg/kg）、中剂量BA组（BA-M组，50 mg/kg）、高剂量BA组（BA-H组，100 mg/kg）、泼尼松组（PNS组，25 mg/kg）、BA-H+cAMP抑制剂（SQ22536）组（100 mg/kg+2.13 mg/kg）、BA-H+PKA抑制剂（H-89）组（100 mg/kg+5 mg/kg），每组12只。除NC组外，其余组大鼠均构建湿疹大鼠模型。建模成功2 d后，分组进行给药处理。检测湿疹面积及严重度指数（EASI）评分、经皮肤水分流失量（TEWL）、角质层含水量（WCSC）变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清中免疫球蛋白E（IgE）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）水平及大鼠背部受试区皮损组织中cAMP蛋白表达；HE染色检测大鼠背部受试区皮损组织病理变化；Western blot检测大鼠背部受试区皮损组织中水通道蛋白3（AQP3）、cathelicidin相关抗菌肽（CRAMP）、p-PKA、p-CREB蛋白表达。结果 与NC组比较，Model组大鼠背部受试区皮损组织病理损伤严重，EASI评分、TEWL、IgE、IL-4水平升高，WCSC、IFN-γ水平、AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平降低（P＜0.05）。与Model组比较，BA-L组、BA-M组、BA-H组、PNS组大鼠背部受试区皮损组织病理损伤减轻，EASI评分、TEWL、IgE、IL-4水平降低，WCSC、IFN-γ水平、AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平升高（P＜0.05）；且BA-L组、BA-M组、BA-H组上述指标变化呈剂量依赖性。SQ22536或H-89减弱了高剂量BA对湿疹大鼠皮肤屏障功能的改善作用。结论 BA可能通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路改善湿疹大鼠皮肤屏障功能。

关键词：湿疹；黄芩苷；环磷酸腺苷/蛋白激酶A/cAMP反应元件结合蛋白通路；皮肤屏障功能

中图分类号：R285.5文献标志码：ADOI：10.11958/20230416

Effect of baicalin regulating cAMP/PKA/CREB signaling pathway on skin barrier function in eczema rats

Abstract： Objective To investigate the effect of baicalin （BA） regulating cyclic adenosine phosphate （cAMP）/protein kinase A（PKA）/cAMP response elemen-binding protein （CREB） pathway on skin barrier function in eczema rats. Methods SD rats were randomly divided into the control group （NC group）， the model group， the low-dose BA group （BA-L group， 25 mg/kg）， the medium-dose BA group （BA-M group， 50 mg/kg）， the high-dose BA group （BA-H group， 100 mg/kg）， the prednisone group （PNS group， 25 mg/kg）， the BA-H+cAMP inhibitor （SQ22536） group （100 mg/kg+2.13 mg/kg） and the BA-H+PKA inhibitor （H-89） group （100 mg/kg+5 mg/kg）， 12 animals in each group. Except for the NC group， eczema rat model was constructed in the other groups. Two days after successful modeling， drug administration was performed in groups. Changes of eczema area and severity index （EASI） score， transcutaneous water loss （TEWL） and cuticle water content （WCSC） were detected. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect levels of immunoglobulin E （IgE）， interferon-γ （IFN-γ） and interleukin-4 （IL-4） in rat serum and the expression of cAMP protein in rat back lesions. HE staining was used to detect pathological changes of skin lesions on the back of rats. Western blot assay was used to detect aquaporin 3 （AQP3）， cathelicidin related antimicrobial peptide （CRAMP）， p-PKA， p-CREB protein expression in rat back lesions. Results Compared with the NC group， rats had serious pathological lesions on the back of the tested area， increased EASI score， TEWL， IgE and IL-4 levels， and decreased WCSC， IFN-γ， AQP3， CRAMP， cAMP， p-PKA and p-CREB protein levels in the model group （P < 0.05）. Compared with the model group， pathological lesion of the tested area in the back of rats was relieved， and EASI score， TEWL， IgE and IL-4 levels were decreased， WCSC， IFN-γ levels， AQP3， CRAMP， cAMP， p-PKA and p-CREB protein were increased in the BA-L group， the BA-M group， the BA-H group and the PNS group （P＜0.05）. Changes of above indexes in the BA-L group， the BA-M group， the BA-H group were dose-dependent. SQ22536 or H-89 attenuated the improvement effect of high dose BA on skin barrier function in eczema rats. Conclusion BA may improve skin barrier function in eczema rats by activating cAMP/PKA/CREB signaling pathway.

Key words： eczema; baicalin; cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A/cyclic-AMP response binding protein pathway; skin barrier function

湿疹是一种具有渗出倾向的慢性炎症性皮肤病，临床表现为红斑、水疱、糜烂、瘙痒等［1］。尽管抗组胺药和糖皮质激素可用于临床治疗，但这些药物往往会导致不良反应，而且费用较高［2-3］。皮肤屏障缺陷是湿疹发病的重要原因之一［4］。因此，开发新的药物改善湿疹过程中的皮肤屏障功能具有重要意义。黄芩苷（Baicalin，BA）是一种从中草药黄芩的根中分离出来的植物性黄酮类化合物，其具有抗炎和抗氧化特性［5］。据报道，BA通过改善皮肤屏障功能减轻特应性皮炎小鼠皮肤损伤［6］，但具体作用机制尚未完全明确。有研究显示，环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/cAMP反应元件结合蛋白（cyclic-AMP response binding protein，CREB）通路中cAMP/PKA的激活可以减轻小鼠银屑病样皮炎［7］。但BA能否通过调控cAMP/PKA/CREB信号通路改善湿疹大鼠皮肤屏障功能鲜见报道。本研究旨在探究BA对湿疹大鼠皮肤屏障功能的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄SPF级雄性SD大鼠96只，体质量200～210 g，购自广东莱迪生物医药研究院有限公司，生产许可证号：SCXK（粤）2022-0064。所有大鼠被饲养在温度（23±2）°C，湿度50%±10%，12 h/12 h黑暗和光照循环的环境中，并提供标准水和食物。动物实验经我院动物伦理委员会批准（批准号：2021-SPF/SQ-62）。

1.2 主要试剂与仪器 BA购自滁州仕诺达生物科技有限公司；cAMP抑制劑SQ22536购自武汉博欧特生物科技有限公司；PKA抑制剂H-89购自上海信裕生物科技有限公司；2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB）购自上海信裕生物科技有限公司；泼尼松（prednisone，PNS）购自上海晶风生物科技有限公司；大鼠免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、干扰素-γ（interferon γ，IFN-γ）、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、cAMP酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海远慕生物科技有限公司；兔源一抗水通道蛋白3（aquaporin3，AQP3）、cathelicidin相关抗菌肽（cathelicidin-related antimicrobial peptide，CRAMP）、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、β-actin及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司。TM300型皮肤测试仪购自德国CK公司；DG5031型酶标仪购自杭州绿博仪器有限公司；CX53型光学显微镜购自日本奥林巴斯公司；DYCZ24DN型蛋白电泳仪购自北京六一仪器厂；GelDoc XR+型凝胶成像系统分析仪购自美国伯乐公司。

1.3 湿疹大鼠模型的构建 参照文献［8］构建湿疹大鼠模型。使用电动剃须刀去除大鼠背部（3 cm×3 cm）的毛发，用移液枪在背部去毛的皮肤上涂抹50 μL 5%DNCB进行第1次致敏，第2周再向相同部位涂抹100 μL 1%DNCB进行激发致敏，每周致敏1次，连续4周。若大鼠背部皮损区域出现红斑、水肿、丘疹、结痂、渗出，则表明模型建立成功。

1.4 动物分组 按照随机数字表法将大鼠分为对照组（NC组）、Model组、低剂量BA组（BA-L组）、中剂量BA组（BA-M组）、高剂量BA组（BA-H组）、PNS组、BA-H+SQ22536组、BA-H+H-89组，每组12只。除NC组外，其余组大鼠均需按照1.3所述方法构建湿疹大鼠模型。建模成功2 d后，进行给药处理，BA-L组、BA-M组、BA-H组［9］、PNS组［10］大鼠分别灌胃25 mg/kg BA、50 mg/kg BA、100 mg/kg BA、25 mg/kg PNS，且均腹腔注射等量的生理盐水；BA-H+SQ22536组［11］大鼠灌胃100 mg/kg BA且腹腔注射2.13 mg/kg SQ22536；BA-H+H-89组［12］大鼠灌胃100 mg/kg BA且腹腔注射5 mg/kg H-89；NC组和Model组大鼠均需灌胃等体积的生理盐水且腹腔注射等体积的生理盐水。给药1次/d，持续14 d。

1.5 标本收集 末次处理24 h后，进行湿疹面积和严重度指数（eczema area and severity index，EASI）评分，并测量经皮肤水分流失量（trans-epidermal water loss，TEWL）、角质层含水量（water content of stratum corneum，WCSC）。上述指标检测结束后，用1%戊巴比妥钠轻度麻醉大鼠，从腹主动脉采集血液并置于离心管中，在4 ℃以3 000 r/min离心30 min，然后将血清储存在-20 ℃用于ELISA。收集血液后，麻醉并处死大鼠，收集大鼠背部受试区皮损组织，分为两部分，每部分包含6只大鼠的皮损组织，一部分浸入4%多聚甲醛中用于HE染色，另一部分储存在液氮中用于ELISA和Western blot实验。

1.6 EASI评分 根据水肿、红斑和抓痕情况进行EASI评分。水肿：无， 0分；轻度， 1分；中度，2分；重度，3分。红斑：无， 0分；轻微， 1分；明显且无痂皮，2分；中度且有轻度痂皮， 3分；重度且有重度痂皮， 4分。抓痕：无，0分；有， 1分。以上3项评分之和即为EASI评分。

1.7 TEWL和WCSC的检测 利用皮肤测试仪水分散失测试探头垂直轻压于被测皮肤表面24 s，记录到的水分流失量即为TEWL；利用皮肤测试仪水分散失测试探头垂直轻压于被测皮肤表面3 s，记录到的含水量即为WCSC。

1.8 ELISA检测大鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平及大鼠背部受试区皮损组织cAMP蛋白水平 按照ELISA试剂盒说明书步骤测定大鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平及大鼠背部受试区皮损组织cAMP蛋白水平。

1.9 HE染色检测大鼠背部受试区皮损组织病理变化 将大鼠背部受试区皮损组织从4%多聚甲醛中取出，脱水、渗透、石蜡浸渍、包埋、切片、染色、密封。用显微镜（×200）进行组织形态学观察，并拍摄照片。

1.10 Western blot检测大鼠背部受试区皮损组织中AQP3、CRAMP、p-PKA、p-CREB蛋白表达 用RIPA裂解缓冲液提取大鼠背部受试区皮损组织中的蛋白质，利用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，将40 μg蛋白在100 V恒压下经12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠电泳分离，然后将蛋白凝胶在0.6 mA/cm2的恒流电流作用下转移2 h，将蛋白转移至PVDF膜上，再将PVDF膜在5%脱脂奶粉中封闭2 h后，将膜与兔抗鼠AQP3（1∶3 000）、CRAMP（1∶2 000）、p-PKA（1∶2 000）、p-CREB（1∶2 000）、PKA（1∶2 000）、CREB（1∶3 000）、β-actin（1∶2 000）一抗在4 ℃下孵育过夜，再与羊抗兔二抗（1∶3 000）孵育2 h。使用ECL试剂对蛋白质条带进行可视化。GelDoc XR+型凝胶成像系统分析仪用于评估蛋白灰度值。

1.11 统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（[[x] ±s

]）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠EASI评分及背部受试区皮损区域TEWL、WCSC比较 与NC组比较，Model组大鼠EASI评分、TEWL升高，WCSC降低（P＜0.05）。与Model组比较，BA-L组、BA-M组、BA-H组、PNS组大鼠EASI评分、TEWL降低，WCSC升高（P＜0.05）；且BA-L组、BA-M组、BA-H组大鼠EASI评分、TEWL依次降低，WCSC依次升高（P＜0.05）。与BA-H组比较，BA-H+SQ22536组、BA-H+H-89组大鼠EASI评分、TEWL升高，WCSC降低（P＜0.05）；PNS组与BA-H组差异无统计学意义，见表1。

2.2 各组大鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平比较 与NC组比较，Model组大鼠血清IgE、IL-4水平升高，IFN-γ水平降低（P＜0.05）。与Model组比较，BA-L组、BA-M组、BA-H组、PNS组大鼠血清IgE、IL-4水平降低，IFN-γ水平升高（P＜0.05）；且BA-L组、BA-M组、BA-H组大鼠血清IgE、IL-4水平依次降低，IFN-γ水平依次升高（P＜0.05）。与BA-H组比较，BA-H+SQ22536组、BA-H+H-89组大鼠血清IgE、IL-4水平升高，IFN-γ水平降低（P＜0.05）；PNS组与BA-H组差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 各组大鼠背部受试区皮损组织病理变化 NC组大鼠角质层、表皮、真皮结构正常。Model组大鼠背部受试区皮损组织结构异常，表现为角化过度，表皮、真皮层存在大量炎性细胞浸润。与Model组比较，BA-L组、BA-M组、BA-H组、PNS组大鼠背部受试区皮损组织病理损伤减轻；与BA-H组比较，BA-H+SQ22536组、BA-H+H-89组大鼠背部受试区皮损组织病理损伤加剧，见图1。

2.4 各组大鼠背部受试区皮损组织中AQP3、CRAMP蛋白及cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白表达变化 与NC组比较，Model组大鼠背部受试区皮损组织中AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平降低（P＜0.05）。与Model组比较，BA-L组、BA-M组、BA-H组、PNS组大鼠背部受试区皮损组织中AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平升高（P＜0.05）；且BA-L组、BA-M组、BA-H组大鼠背部受试区皮损组织中AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平依次升高（P＜0.05）。与BA-H组比较，BA-H+SQ22536组大鼠背部受试区皮损组织中AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平降低（P＜0.05）；BA-H+H-89组大鼠背部受试区皮损组织中AQP3、CRAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平降低（P＜0.05），cAMP蛋白差异无统计学意义（P＞0.05）；PNS组与BA-H组差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、表3。

3 讨论

湿疹是一种以瘙痒性湿疹性病变为特征的慢性炎症性皮肤病［13］。本研究采用DNCB诱导构建湿疹大鼠模型。当皮肤受到DNCB刺激后再次接触同一抗原时，会发生Ⅳ型过敏反应，反复刺激可产生类似湿疹的表现。本研究结果显示，Model组大鼠EASI评分、TEWL升高，WCSC降低，背部受试区皮损组织病理损伤严重，反映大鼠皮肤水分大量散失，表皮角质层含水量减少，进而引起皮损组织病理损伤，提示经DNCB反复诱导的大鼠皮肤屏障功能异常。AQP3是在皮肤中研究最多的一种蛋白，其在皮肤屏障恢复中可发挥重要作用，若AQP3缺失可能会导致皮肤弹性下降、皮肤屏障修复延迟，进而引起湿疹等皮肤病的发生［14-15］；CRAMP是皮肤抵御微生物入侵的第一道防线，上调皮损组织中CRAMP蛋白表达可改善特应性皮炎小鼠皮肤屏障功能［16］。本研究结果显示，与NC组比较，Model组大鼠背部受试区皮损组织中AQP3、CRAMP蛋白水平降低，再次证实湿疹模型大鼠皮肤屏障功能异常。

BA是一种从黄芩根中分离的亲脂性黄酮苷，其具有强大的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗癌和抗病毒等［17］。BA可对长波紫外线诱导的小鼠皮肤氧化损伤和炎症发挥保护作用［18］；BA还可抑制痤疮丙酸杆菌诱导的大鼠皮肤炎症［9］及银屑病小鼠皮肤炎症［19］。以上研究结果表明BA对多种皮肤炎症疾病具有较好的抑制作用。而关于BA对湿疹大鼠皮肤屏障功能的影响鲜有报道。本研究结果显示，BA可呈剂量依赖性地降低EASI评分和TEWL，升高WCSC，改善背部受试区皮损组织病理损伤，而BA-H组与PNS组大鼠上述指标无明显差异，表明BA可改善湿疹大鼠皮肤屏障功能。

免疫失衡在湿疹的发病机制中起重要作用，尤其是Th1/Th2失衡。IFN-γ主要由Th1细胞分泌，可抑制Th2细胞分泌IL-4，同时抑制B细胞产生IgE。IL-4主要由Th2细胞分泌，主要抑制Th1细胞功能，促进B细胞产生IgE，两者相互抑制、拮抗，维持Th1/Th2平衡［20］。正常人体内IFN-γ和IL-4水平保持相对平衡状态，而湿疹患者则失去了这种状态。本研究结果显示，与NC组比较，Model组大鼠血清IgE、IL-4水平升高，IFN-γ水平降低，提示Model組大鼠存在Th1/Th2失衡。而BA可呈剂量依赖性地降低大鼠血清IgE、IL-4水平，升高IFN-γ水平，提示BA可促进湿疹大鼠Th1/Th2平衡。BA可能成为临床上治疗湿疹的潜在有效药物。

cAMP在细胞中广泛表达，PKA是cAMP的主要靶标，当细胞中cAMP水平升高时，其结合PKA底物，使PKA磷酸化，进而会进一步磷酸化CREB；CREB磷酸化可启动基因转录，从而调节细胞分化、增殖、凋亡和代谢［21］。还有研究显示，激活PKA/CREB信号通路可改善皮肤炎症性疾病相关色素沉着障碍［22］。而关于cAMP/PKA/CREB信号通路对湿疹大鼠皮肤屏障功能的影响尚鲜见报道。本研究结果显示，BA可呈剂量依赖性地上调湿疹大鼠背部受试区皮损组织中cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白表达，提示BA可能通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路改善湿疹大鼠皮肤屏障功能。为验证此猜想，本研究在高剂量BA作用的基础上联合cAMP抑制剂SQ22536或PKA抑制剂H-89来干预湿疹大鼠，结果显示，SQ22536或H-89减弱了高剂量BA对湿疹大鼠皮肤屏障功能的改善作用。

综上所述，BA可能通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路改善湿疹大鼠皮肤屏障功能，其具体作用机制及是否涉及其他通路尚待进一步研究探讨。

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