lincRNA-p21在酒精性肠道损伤中的作用

孙楠，张超，王标，张沁雨，张淑惠，赵敬杰

1 山东大学第二医院检验医学中心，济南 250033；2 青岛市市立医院医学检验部；3 北京大学人民医院青岛医院检验科；4 山东中医药大学康复医学院

酒精性肝病是导致慢性肝病的重要原因，肠道屏障损伤和肠道菌群失调是其重要的发病机制［1］。肠上皮细胞通过紧密连接蛋白紧密结合在一起，其上覆盖黏液，定植着肠道菌群，与固有层免疫细胞共同形成肠道屏障。饮酒后，肠道菌群与宿主正常的共生关系被破坏，菌群多样性降低，菌群种属和数量发生不同程度改变，肠上皮紧密连接的完整性被破坏，肠道通透性增加［2］。影响肠道屏障和肠道微生物群落组成的因素有很多，如饮食习惯、宿主遗传因素［3］。而酗酒者的肠道屏障损伤和肠道菌群改变各有不同，表明宿主遗传因素在酒精性肠道损伤中起到至关重要的作用。长链非编码RNA及其亚型基因间长链非编码RNA（lincRNA）是长度大于200个碱基的非编码RNA，能够在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等方面发挥重要作用。lincRNA-p21是目前研究较多的一种lincRNA，可参与多种重要的生物学过程。本课题组前期研究发现，原发性肝病患者血清lincRNA-p21 水平升高［4］。但lincRNA-p21 对酒精所致肠道屏障损伤和肠道菌群失调的影响尚不清楚。2018年1月—2022年12月，本研究探讨了lincRNA-p21在酒精性肠道损伤中的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性C57BL/6Cnc 小鼠15 只，SPF 级，6周龄，体质量（18 ± 2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。雄性CRISPR/Cas9 技术Trp53cor1 基因敲除C57BL/6 小鼠（lincRNA-p21-/-）5 只，SPF 级，11 周龄，体质量（24 ± 2）g，由赛业生物科技有限公司构建。所有小鼠分笼饲养，每笼5 只，自由摄食和饮水，饲养环境：温度（21 ± 2）℃、相对湿度（50 ± 10）%、光照12 h/12 h 明暗交替。研究设计与实施过程符合动物福利和伦理原则，并经山东大学第二医院动物研究伦理委员会批准。

lincRNA-p21-over-AAV8-U6-GFP 病毒及其对照（control-AAV8-U6-GFP）病毒，购自美国Vigene Biosciences 公司。引物序列由广州锐博生物技术有限公司和济南博尚生物技术有限公司设计合成。CFX-96 实时定量PCR 仪，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；超薄切片机，购自德国Leica公司；Pannoramic 250 数字切片扫描仪，购自匈牙利3DHISTECH 公司。Prime ScriptTMRT Reagent Kit 和SYBR Premix Ex TaqTMReagent Kit，购自宝生物工程（大连）有限公司。抗GFP 抗体、抗claudin-1 抗体和抗ZO-1抗体，购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.2 动物模型构建 将15 只C57BL/6Cnc 小鼠适应性喂养1 周，随机取10 只，随机分为lincRNA-p21过表达组和对照组各5 只，分别于尾静脉注射lincRNA-p21-over-AAV8-U6-GFP病毒、control-AAV8-U6-GFP 病毒。以Trp53cor1 基因敲除C57BL/6 小鼠（lincRNA-p21-/-）为突变组，以剩余5 只C57BL/6Cnc小鼠作为野生组，不做任何处理。尾静脉注射4 周后，lincRNA-p21 过表达组与对照组、突变组与野生组分别予含5%酒精的液体饲料连续喂养4周，最后3 天同时予40%酒精5 g/kg 灌胃，建立酒精性损伤模型。末次灌胃12 h，麻醉后眼底静脉丛取血，检测血清ALT、AST。若ALT＞37 U/L 和AST＞40 U/L，则酒精性损伤模型构建成功。

1.3 小肠组织lincRNA-p21 表达检测 处死小鼠，留取小肠组织，-80 ℃冰箱保存。取部分小肠组织，液氮下研磨成粉末，采用TRIzol法提取组织总RNA，经NanoDrop2000 超微量分光光度计鉴定，提取的总RNA 浓度和纯度合格。按Prime ScriptTMRT Reagent Kit说明将总RNA 逆转录合成为cDNA。以cDNA 为模板，按照SYBR Premix Ex TaqTM说明进行PCR扩增。引物序列：lincRNA-p21上游引物5'-CCCCATAGCCACAACTCTCTG-3'、下游引物5'-AAGTTCTTGCCCTGGGTCTTTG-3'，扩增产物长度149 bp；β-actin 上游引物5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'、下游引物5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'，扩增产物长度154 bp。PCR 反应体系共20 µL：2 × SYBR Green Mix 10 µL，cDNA 模板1 µL，上下游引物各0.8 µL，ddH2O 补足至20 µL；反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s 共35个循环。PCR反应结束，绘制熔解曲线，获取循环阈值（CT）数。以β-actin 为内参，采用2-ΔΔCT法计算lincRNA-p21相对表达量。

1.4 小肠组织病理形态观察 剪取部分小肠组织，10%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，常规浸蜡、包埋，4 µm 厚连续切片。石蜡切片脱蜡至水，苏木素染色，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，伊红染色，常规脱水、透明，中性树胶封固，显微镜下拍照观察。

1.5 小肠组织紧密连接蛋白表达检测 将小肠组织切片于抗原修复缓冲液中加热修复抗原，BSA 封闭，分别滴加claudin-1、ZO-1 一抗，4 ℃孵育过夜。次日，滴加与一抗相应种属的二抗，室温避光孵育。DAPI复染细胞核，室温避光孵育。抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并采集图像。采用Image J软件分析小肠组织紧密连接蛋白表达。

1.6 肠道菌群测序 处死小鼠，取盲肠内容物，-80 ℃冻存。由北京阅微基因技术股份有限公司提取盲肠内容物的微生物DNA，并进行16S 扩增子测序，分析菌群多态性和组成等。

1.7 统计学方法 采用GraphPad Prism 8统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，结果比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小肠组织lincRNA-p21 表达比较lincRNA-p21过表达组与对照组小肠组织lincRNA-p21相对表达量分别为47.13 ± 18.36、2.44 ± 1.11，lincRNA-p21 过表达组小肠组织lincRNA-p21 相对表达量高于对照组（t=5.31，P＜0.05）。突变组与野生组小肠组织lincRNA-p21 相对表达量分别为0.05 ±0.04、1.11 ± 0.60，突变组小肠组织lincRNA-p21 相对表达量低于野生组（t=3.95，P＜0.01）。

2.2 各组小肠组织病理形态观察 小肠组织HE染色显示，各组均出现肠道损伤，肠黏膜可见粒细胞、单核细胞浸润。与对照组比较，lincRNA-p21过表达组肠道损伤较重，肠绒毛空泡化增多，肠黏膜细胞结构较紊乱，肠壁水肿和肠壁隐窝损伤较重；与野生组比较，突变组肠绒毛空泡化减少，肠黏膜细胞结构较条理，肠壁水肿和肠壁隐窝损伤较轻。

2.3 各组小肠组织紧密连接蛋白表达比较lincRNA-p21 过表达组与对照组claudin-1 相对表达量分别222.40 ± 1.06、237.70 ± 0.71，ZO-1相对表达量分别为238.40 ± 1.07、243.50 ± 0.51，lincRNA-p21过表达组claudin-1、ZO-1 相对表达量均低于对照组（t分别为20.84、7.57，P均＜0.01）。突变组与野生组claudin-1相对表达量分别为221.60 ± 3.58、209.70 ±1.01，ZO-1相对表达量分别为239.30 ± 2.89、225.30 ±2.20，突变组claudin-1、ZO-1 相对表达量均高于野生组（t分别为5.53、6.69，P均＜0.01）。

2.4 小肠组织lincRNA-p21 表达对肠道菌群的影响 肠道菌群测序结果显示，lincRNA-p21过表达组与对照组、突变组与野生组肠道优势菌群均为厚壁菌门或拟杆菌门。与对照组比较，lincRNA-p21过表达组与对照组肠道菌群中放线菌门丰度分别为0.049 ± 0.017、0.016 ± 0.004，lincRNA-p21 过表达组肠道菌群中放线菌门丰度高于对照组（t=4.21，P＜0.01）。突变组与野生组肠道菌群中蓝藻菌门丰度分别为0.000 19 ± 0.000 17、0.004 10 ± 0.003 30，突变组肠道菌群中蓝藻菌门丰度低于野生组（t=2.62，P＜0.05）。KEGG 分析发现，lincRNA-p21 过表达和基因敲减对酒精暴露小鼠肠道菌群功能的影响涉及氨基酸代谢、脂质代谢、营养物质消化吸收以及细胞生长和死亡等方面。

3 讨论

饮酒是15～49岁人群过早死亡和残疾的第五大风险因素。饮酒后，肠道菌群与宿主正常的共生关系被破坏，肠道菌群多样性降低，菌群种属和数量会发生不同程度改变，肠上皮紧密连接的完整性被破坏，肠道屏障通透性增加［2］。肠道屏障损伤和肠道菌群失调是酒精性肠道损伤的重要发病机制。而肠道损伤则可通过肝肠轴、脑肠轴造成全身多个器官损伤和功能障碍，如酒精性肝病、酒精性脑病和胰腺炎等。

酗酒者肠道屏障损伤和肠道菌群改变各有不同，表明宿主遗传因素可能在酒精性肠道损伤中起到至关重要的作用。lincRNA-p21 定位于人染色体6p21.2，位于细胞周期调节基因p21/CDKN1A上游约15 kb 处，长度约3 kb，是新发现的一种与细胞增殖、凋亡和DNA 损伤反应有关的调节因子。lincRNA-p21 可通过与MDM2 结合而抑制MDM2 介导的p53泛素化和降解，进而促进p53依赖性细胞凋亡。lincRNA-p21具有转录后调控功能，可在多种生物学过程中发挥重要作用［5］。1-甲基-4-苯基吡啶离子可上调神经母细胞瘤lincRNA-p21表达，通过调节Wnt/β-catenin信号通路以及促进氧化应激而加速神经母细胞瘤细胞衰老［6］。因此，靶向lincRNA-p21 可能对神经母细胞瘤治疗具有重要价值。在非肿瘤性疾病中，lincRNA-p21可上调自噬水平而抑制阿尔茨海默病的神经炎症反应［7］；ROS 可诱导lincRNA-p21表达而加速平滑肌细胞表型转化，从而促进腹主动脉瘤形成［8］。在正畸治疗中，机械压力可诱导lincRNA-p21 表达上调，而敲低lincRNA-p21 则可下调自噬水平，抑制牙骨质母细胞的矿化能力［9］。lincRNA-p21在缺血再灌注的心肌细胞中表达上调，敲减lincRNA-p21 则可减少心肌缺血再灌注损伤小鼠的梗死面积，改善心功能。究其机制，lincRNA-p21可通过吸附miR-466i-5p，上调NR4A2 表达，促进缺血再灌注损伤的心肌细胞凋亡［10］。以上研究表明，lincRNA-p21在人类疾病的发生、发展中扮演重要角色。本课题组前期研究发现，lincRNA-p21在酒精性肝病中表达上调［4］。本研究结果发现，lincRNA-p21能够加重酒精性肠道损伤。进一步证实，lincRNA-p21在酒精性肠道损伤中亦发挥重要作用。

claudin-1、ZO-1 是肠道细胞间重要的紧密连接蛋白，也是维护肠道屏障功能的重要蛋白质［11］。肠道屏障能够阻止肠道内有害物质穿过肠黏膜进入人体其他组织、器官或血液循环。为了研究lincRNA-p21过表达和基因敲除对肠道屏障功能的影响，本研究观察了肠组织紧密连接蛋白claudin-1、ZO-1 表达，结果发现lincRNA-p21 过表达能够降低紧密连接蛋白claudin-1、ZO-1 表达，增加肠道屏障损伤；而lincRNA-p21 敲减则可增加紧密连接蛋白claudin-1、ZO-1表达，减轻肠道屏障损伤。结果表明，lincRNA-p21在酒精性肠道损伤中的作用可能是通过影响紧密连接蛋白表达实现的。

酒精喂养会导致动物肠道微生物组成发生明显变化，如酒精喂养小鼠肠道菌群厚壁菌门相对丰度降低，拟杆菌门和Verrucomirobia相对丰度增加。一些酗酒者可表现出明显的肠道菌群失调，如拟杆菌减少，厚壁菌和变形杆菌增多。酗酒可导致肝硬化患者肠道菌群失调，可能有助于肝硬化进展［12］。肠道菌群组成由多种因素决定，包括饮食习惯、宿主遗传因素。现阶段对酒精性肝病宿主遗传背景与肠道菌群关系的认识还非常有限。有研究发现，肠道微生物群通过抑制长链非编码RNA Snhg9表达来重编程肠道的脂质代谢［13］。有研究报道，放线菌门在炎症性肠病患者肠道菌群中的丰度增加［14］，蓝藻菌门在自身免疫性疾病患者中的丰度增加［15］。本研究结果发现，lincRNA-p21过表达可增加肠道菌群中放线菌门的丰度，而该基因敲减则可降低蓝藻菌门的丰度。结果表明，lincRNA-p21表达变化在一定程度上可影响酒精饮食小鼠的肠道菌群结构，而敲减lincRNA-p21或可起到保护作用。

综上所述，lincRNA-p21过表达能够加重酒精性肠道损伤，而敲减lincRNA-p21 则可减轻酒精性肠道损伤，其机制可能与增加或减少肠道屏障损伤以及改变肠道菌群结构有关。因此，靶向lincRNA-p21或可成为酒精性肠道损伤的治疗策略之一。