茶黄素通过调节Wnt/β-catenin 和Hedgehog 信号通路对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

郭永木，苏亚勇，刘双平，王丽惠，徐成润

［中国人民解放军联勤保障部队第九〇九医院（厦门大学附属东南医院）感染科，福建 漳州 363100］

目前，原发性肝癌严重威胁人民的生命和健康[1]。由于肝癌的发生发展是一个复杂的过程，治疗方法也呈多样化。越来越多的研究表明，中医药在治疗癌症方面有明显优势，可降低癌症的复发率，提高患者的生存质量[2]。茶黄素（theaflavins）是从红茶或绿茶中提取的一类天然产物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、降脂、抗突变、抗肿瘤和调节免疫细胞功能等药理作用，尤其在多种肿瘤中如胃癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌及乳腺癌等显示抗肿瘤活性，一度被认为是癌症新药研发的新方向[3−5]。本研究通过细胞实验探讨茶黄素通过调控Wnt/β-catenin和Hedgehog 信号通路对HepG2 细胞增殖和凋亡的影响，旨在阐明茶黄素在HepG2 细胞中的调控机制，为其抑制肝细胞癌的基础研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

肝癌HepG2 细胞购于上海酶研生物科技有限公司；茶黄素（质量分数≥98%，BP1384）购于成都普瑞法生物技术有限公司（批号：BP1384）；CCK-8 试剂盒购于Dojindo Molecular Technologies 公司（批号：CK04-11）；GAPDH（批号：P04406，36 kDa）、Ki67（批号：E9PVX6，351 kDa）、PCNA（批号：P12004，31 kDa）、cleaved caspase-3（批号：P42574，32 kDa）、caspase-3（批号：P42574，32 kDa）、cleaved caspase-9（批号：P55211，46 kDa）、caspase-9（批号：P55211，46 kDa）、GLi1（批号：P08151，150 kDa）、SMO（批号：Q99835，86 kDa）、β-catenin（批号：P35222，92 kDa）、c-myc（批号：P01106，49 kDa）和Cyclin D1（批号：P24385，34 kDa）均购于美国Proteintech Group 公司；PTch1（批号：ab53715，161 kDa）购于美国Abcam 公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（批号：88-8102-72）购于美国ThermoFisher 公司；SYBR Premix Ex TaqTM（批号：DRR081A）试剂盒购于日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在含10%（φ）胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中加入肝癌HepG2 细胞，并将细胞培养瓶放置在37 ℃、5%（φ）CO2浓度条件的细胞培养箱中，进行恒温培养。

1.2.2 CCK-8 试验检测HepG2 细胞活性 筛选对数生长期的肝癌HepG2 细胞，将细胞培养瓶中的肝癌HepG2 细胞进行稀释，取5×104个/L 细胞接种于96孔板中，用0、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L的茶黄素分别进行处理，每个浓度设置3个平行孔，然后分别培养24、48、72 h。培养不同时间段后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在37 ℃条件下孵育1 h。最后，在450 nm 波长下测量各孔吸光度值（A），以0 μmol/L 茶黄素作为对照组，计算细胞活性。HepG2 细胞存活率=（实验组A 值/对照组A值）×100%。取3次实验平均值计算存活率。

1.2.3 实验分组 根据细胞活性实验结果，筛选对数生长期的肝癌HepG2细胞，将肝癌HepG2细胞进行稀释，细胞浓度调整为5×104个/mL，用0、20、40、80 μmol/L 的茶黄素分别培养24 h。实验分为4 组：空白对照组（不给予任何药物处理）、茶黄素低剂量（20 μmol/L）组、茶黄素中剂量（40 μmol/L）组和茶黄素高剂量（80 μmol/L）组。

1.2.4 流式细胞术检测HepG2 细胞凋亡 筛选对数生长期的肝癌HepG2 细胞，将细胞培养瓶中的肝癌HepG2 细胞进行稀释，取5×104个细胞接种于6孔板，培养过夜。分别添加20、40、80 μmol/L 的茶黄素，孵育24 h 后，然后使用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶收集细胞，依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 溶液和10 μL PI 溶液，室温避光孵育30 min，流式细胞仪（美国贝克曼，DxFLEX）检测细胞凋亡。

1.2.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测mRNA 相对表达量 取经茶黄素（0、20、40、80 μmol/L）处理并培养24 h 的肝癌HepG2 细胞，用Trizol 裂解液裂解细胞，然后提取总RNA。按照qRT-PCR试剂盒说明书，将总RNA 逆转录为cDNA，并制备50 μL 反应体系，用于DNA 扩增。荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad 公司，CFX9 real-time PCR 仪）检测mRNA 的相对表达量，PCR 反应条件：首先是95 ℃预变性5 min，然后是95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，以上进行35 个循环处理。用2−ΔΔCt法分析GLi1、SMO、PTch1、β-catenin、c-myc 和Cyclin D1 的mRNA 相对表达量[6]，取3 次实验平均值计算结果。

1.2.6 Western blot 检测蛋白表达量 将RIPA 裂解缓冲液与蛋白酶抑制剂按照100∶1 的体积比混合，加入茶黄素处理（0、20、40、80 μmol/L 处理并培养24 h）后的肝癌HepG2 细胞中，置于冰块中，裂解30 min，12 000 r/min 离心10 min，离心后，去掉上清液，收集细胞总蛋白，最后采用BCA 试剂盒测定蛋白浓度。将收集的蛋白质样品通过SDS-PAGE进行分离，然后进行转膜，用现配置的5%脱脂牛奶在室温下封闭2 h，然后用TBST 清洗液清洗膜，每次3 min，共3 次。根据说明书，加入对应浓度GAPDH、Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、caspase-3、cleaved caspase-9、caspase-9、GLi1、SMO、PTch1、β-catenin、c-myc和Cyclin D1的一抗，在4 ℃的条件下孵育过夜，再TBST缓冲液，每次3 min，共3次；然后加入对应浓度的二抗，在室温条件下孵育2 h，再TBST缓冲液，每次3 min，共3次。最后在避光的条件下，加入ECL发光染色，使用凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司，ChemiDocM）进行分析，用TotalLab 2.0进行灰度计算，GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量，取3次实验平均值计算结果。

1.2.7 数据分析 采用SPSS 20.0统计学软件进行统计处理。所有结果用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，LSD-t法进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 茶黄素对肝癌HepG2细胞活性的影响

如图1 所示，随着茶黄素浓度的增加，肝癌HepG2 细胞活性显著下降；在相同茶黄素浓度下，随着培养时间增加，肝癌HepG2 细胞活性显著下降。培养24 h，茶黄素浓度为＜80 μmol/L 时，肝癌HepG2 细胞活性＞70%。因此，本研究选取浓度为20、40、80 μmol/L的茶黄素进行后续研究。

图1 茶黄素对肝癌HepG2细胞活性的影响Figure 1 Effect of theaflavins on HepG2 cell activity

2.2 茶黄素对肝癌HepG2细胞增殖的影响

如图2所示，克隆形成实验结果显示，与空白对照组相比，茶黄素显著抑制肝癌HepG2 细胞的增殖，其中茶黄素浓度为40 μmol/L和80 μmol/L，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot结果显示，随着茶黄素浓度增加，Ki67 和PCNA 蛋白的表达量显著下调。

图2 茶黄素对肝癌HepG2细胞增殖的影响Figure 2 Effect of theaflavins on HepG2 cell proliferation

2.3 茶黄素对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

如图3所示，在流式细胞术实验中，与空白对照组相比，茶黄素显著诱导肝癌HepG2 细胞的细胞凋亡，其中茶黄素浓度为40 μmol/L和80 μmol/L，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot结果显示，随着茶黄素浓度增加，cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9蛋白的表达量显著上调。

图3 茶黄素对肝癌HepG2细胞凋亡的影响Figure 3 Effect of theaflavins on HepG2 cell apoptosis

2.4 茶黄素对Hedgehog信号通路的影响

如图4 所示，qRT-PCR 结果显示，随着茶黄素浓度增加，GLi1、SMO 和PTch1 mRNA 相对表达量显著降低。Western blot结果显示，随着茶黄素浓度增加，GLi1、SMO和PTch1蛋白的表达量显著下调。

图4 茶黄素对Hedgehog信号通路的影响Figure 4 Effect of theaflavins on Hedgehog signaling pathway

2.5 茶黄素对Wnt/β-catenin信号通路的影响

如图5 所示，qRT-PCR 结果显示，随着茶黄素浓度增加，β-catenin、c-myc和Cyclin D1 mRNA相对表达量显著降低。Western blot结果显示，随着茶黄素浓度增加，β-catenin、c-myc 和Cyclin D1 蛋白的表达量显著下调。

图5 茶黄素对Wnt/β-catenin信号通路的影响Figure 5 Effect of theaflavins on Wnt/β-catenin signaling pathway

3 讨论

原发性肝癌具有较高的发病率和致死率，是全世界最为常见的恶性肿瘤之一[7]。近年来，随着人们生活、工作等方式的改变、饮食结构的变化以及老年化加剧，导致肝癌的发病率逐年上升。目前可用于治疗肝癌的手段为局部治疗（手术、消融、栓塞、放疗）和系统治疗（靶向治疗、免疫治疗、化疗），这些方法能显著改善患者生存期和提高患者生活质量，但仍存在局限性，即肝癌治愈率、患者5年生存率普遍较低，因此探索治疗肝癌的研究仍然任重道远，需要进一步寻找更为有效的治疗策略[8−9]。近年来，大量研究证实了茶黄素的生物活性、药用价值及其保健功能[10]，即其能够促进肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞有丝分裂阻滞并调节肿瘤免疫，以及通过调节PI3K/AKT、MAPK、NF-κB、JAK/STAT、Hedgehog及Wnt/β-catenin等信号通路抑制肿瘤发生和生长[4]。

研究表明，Wnt/β-catenin 和Hedgehog 信号通路在组织生长发育的调控中发挥重要作用[11]。其中Hedgehog（Hh）通路通常在哺乳动物的胚胎发育、纤毛运动、肿瘤发生过程中被激活，主要包括3个家族成员及配体Sonic hedgehog（SHh）、Indian hedgehog（IHh）和Desert hedgehog（DHh），12-跨膜受体PTch1 和PTch2，7-跨膜G 蛋白偶联受体Smoothened（SMO），转录因子GLil、GLi2 和GLi3[12−13]。研究发现，经过茶黄素处理后，GLi1、SMO 和PTch1 mRNA相对表达量以及蛋白表达量均显著下调，表明茶黄素能抑制Hedgehog 信号通路从而调控肝癌HepG2细胞的增殖和凋亡。另外，Wnt/β-catenin 通路中核心蛋白为β-catenin 蛋白，是Wnt 的效应器[13]。在本研究中，经过茶黄素处理后，β-catenin mRNA 相对表达量以及蛋白表达量均显著下调，表明茶黄素能抑制Wnt/β-catenin 信号通路从而调控肝癌HepG2细胞的增殖和凋亡。研究发现，GLil 是转录激活因子，它可以诱导内源性卷曲相关蛋白1（secreted frizzled-related protein-1，SFRP-1），使SFRP-1 表达量增加。SFRP1 是Wnt 信号通路的负调控因子，Hedgehog 通路可通过上调SFRP1 的表达量抑制Wnt信号通路相应蛋白的表达量[14]。已证明典型的Hedgehog 信号通过诱导Cyclin D1 和c-myc基因在细胞增殖中起重要作用，当细胞膜上的PTch1 与配体配对结合后可以激活Hedgehog 信号通路，诱发GLi2 转录因子的表达，继而影响到GLi1、Bcl-2、c-Flip、Cyclin D1、c-myc 及VEGF 靶基因的表达，从而激发肿瘤细胞增殖[15−16]。在细胞增殖过程中，细胞周期中重要调控蛋白Cyclin D1能加快细胞从G1期进入S期，缩短细胞增殖周期的时间，导致细胞过度增殖，因此该通路被认为是肝癌治疗的重要靶点[15−16]。本研究结果表明，经茶黄素处理后，c-myc和Cyclin D1 mRNA 相对表达量和蛋白表达量显著下调；克隆形成实验结果显示，茶黄素能显著抑制肝癌HepG2 细胞的增殖，并且显著下调Ki67 和PCNA 蛋白的表达量。Wnt/β-catenin 信号通路参与了HCC在内恶性肿瘤上皮间质转化，并影响癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭，是肝癌发生发展的最重要的信号通路之一[13，17]。流式细胞实验结果显示，茶黄素显著诱导肝癌HepG2细胞的细胞凋亡，并且显著上调cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表达量。

综上所述，本研究表明茶黄素可以抑制肝癌HepG2 细胞增殖、促进HepG2 细胞凋亡，其作用机制可能是通过调控Wnt/β-catenin 和Hedgehog 信号通路来实现的，未来仍需进一步深入验证该调控机制，以期实现茶黄素辅助治疗肝癌的临床应用。