基于机器视觉系统佛手炮制前后的判别及颜色-成分相关性分析

陈维玲，陈倩茹，孟江，李旺君，陈烨昕，陈志维，张戴英

（1.广东药科大学中药学院/国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室/广东高校中药质量工程技术研究中心，广东 广州 510006；2.广州至信中药饮片有限公司，广东 广州 511400；3.东莞广州中医药大学研究院，广东 东莞 523000；4.广东和翔制药有限公司，广东 广州 510000）

佛手是芸香科植物佛手Citrus medicaL. var.Sarco-dactylis Swingle 的干燥果实。其性辛、苦、酸、温，归肝、脾、胃、肺经。具有疏肝理气、和胃止痛、燥湿化痰的作用，用于肝胃气滞、胸胁胀痛、胃脘痞满、食少呕吐、咳嗽痰多等症状[1]。在岭南地区，临床使用的佛手饮片多为蒸制后的制佛手，蒸后其辛燥之性降低[2]。目前对佛手炮制前后的质量控制，多依靠人体感官为主进行鉴别，2020 年版《中华人民共和国药典》关于佛手的标准为“外皮黄绿色或橙黄色，有皱纹和油点。果肉浅黄白色或浅黄色，散有凹凸不平的线状或点状维管束。质硬而脆，受潮后柔韧。气香，味微甜后苦”[1]。关于蒸佛手性状描述为：“蒸后呈棕黄色或棕黑色”[2]。传统的质量鉴别方法具有较强的主观性，且易受到周围环境的影响，无法客观标准化。

机器视觉是指计算机通过实现人的视觉功能，对客观世界的三维场景进行感知、识别和理解，具有非破坏性、精度高、成分效率高、信息量大、灵活等特点[3]。它可以在保证高精度图像识别和高灵活图像处理的同时快速地在海量信息中获取所需要的信息，将大量图像信息输入到计算机中构建数据库。通过计算机相关软件与建立的图像数据库进行互相配合，在短时间内快速地比对提取到的重要特征信息，完成数据信息分析、对比、去除和保持等[4]。机器视觉融合机器学习可以对中药材的颜色特征进行采集，从而转化成数字，利用计算机对得到的数据进行对比来对饮片进行实际鉴别和质量控制。目前，机器视觉系统在中药饮片的定性定量分析中得到广泛应用。

佛手中的主要活性成分为黄酮及其苷类、香豆素类等化合物[5]。现代药理研究表明，佛手中的香豆素具有抗感染、抗菌、抗癌、降血脂等作用[6]，其中6，7-二甲氧基香豆素有抗感染、抗肿瘤、保肝和心血管活性等作用[7−8]；莨菪亭具有抑菌、抗衰老、抗感染、镇痛、利尿、保肝等多种药理作用[9]。佛手中的类黄酮可以降低血清中的脂质水平[10]，其主要活性单体成分橙皮苷可以改善2型糖尿病的胰岛素抵抗指数[11]。本文选择橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭为佛手和蒸佛手的指标性成分，采用HPLC 法测定这3 种成分的质量分数，再通过机器视觉系统对饮片颜色特征进行数字化信息处理，利用主成分分析（principal component analysis,PCA）、线性判别分析（principal component analysis,LDA）、偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA）和支持向量机（support vector machine, SVM）等机器学习算法建立快速判别模型，并对其颜色特征值与各化学成分质量分数进行相关性分析，为佛手炮制工艺的控制和质量评价提供参考依据。具体研究思路见图1。

图1 佛手炮制前后颜色-成分相关性分析的研究思路图Figure 1 The research idea diagram of color component correlation analysis before and after the processing of Citrus medica

1 仪器、材料与试药

1.1 仪器

LC-20A 型HPLC 仪（日本Shimadzu 公司）、JP-105A型高速多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司）、BSA124S 型万分之一电子天平（德国Sartorius公司）、KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率150 W、频率40 kHz）、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、机器视觉系统主要包括光箱（封闭反光板组成）、光源（光箱顶部两侧各带2 个18 W 灯管，其光源色温为5400 K）（见图2）、FUJI X-T2 型数码相机（日本Fuji 公司）。

图2 机器视觉系统Figure 2 Machine vision system

1.2 药品与试剂

收集广东不同饮片企业的生制佛手样品共60批，经广东药科大学中药学院刘基柱副教授鉴定为芸香科植物佛手Citrus medicaL.var.sarco-dactylis Swingle 的干燥果实的炮制加工品，详细信息见表1，佛手饮片见图3。其中生品（S1～S30）和炮制品（Z1～Z30）各30 批，制佛手按照《广东省中药饮片炮制规范》进行炮制：喷水后蒸2～3 h，取出，晒干。6，7-二甲氧基香豆素（批号：CHB201102）、莨菪亭（批号：CHB201202）均购自成都克洛玛生物科技有限公司，橙皮苷（批号：RFS-C00601910011）购自成都瑞芬思生物科技有限公司，质量分数均大于98%。甲醇、乙腈为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水。

表1 佛手饮片样品信息表Table 1 Sample information of Citrus Medica

图3 佛手饮片原始图像Figure 3 Original image of Citrus Medica

2 方法与结果

2.1 多成分质量分数的测定

2.1.1 混合对照品储备液的制备 分别取橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中加甲醇定容配置成质量浓度分别为228.00、76.50、74.25 μg/mL 的混合对照品储备液，密封置于4 ℃保存备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取已过5 号筛的佛手生品和制品粉末各1 g，分别精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，盖紧瓶盖，置KQ-300DE 型数控超声波清洗器中超声45 min，放至室温，用甲醇补足质量，摇匀，静置，取上层溶液，过0.22 μm微孔滤膜，取滤液，密封保存。

2.1.3 色谱条件 色谱柱为UltimateTMXB-C18色谱柱（5µm，4.6 mm×250 mm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～5 min，15%（体积分数，下同）B→23%B；5～15 min，23%B→28%B；15～30 min，28%B→50%B；30～46 min，50%B→85%B；46 ～47 min，85%B→95%B；47 ～50 min，95%B→98%B。检测波长：330 nm；柱温：35 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL。

2.1.4 标准曲线的绘制 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液，照倍比稀释法分别吸取0.5、1.0、2.5 和5.0 mL 的混合对照品溶液，放置在10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，与混合对照品储备液组成5个浓度梯度的混合对照品溶液。按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，以对照品质量浓度为横坐标（X）、其峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。得到橙皮苷、莨菪亭、6，7-二甲氧基香豆素的回归方程分别为Y1=2.639 2×104X1−2.984 2×104（R12=0.999 3），线性范围为7.125 0～228.000 μg/mL；Y2=7.960 2×104X2−3.007 9×104（R22=0.999 8），线性范围为2.390 9～76.500 μg/mL；Y3=8.520 1X3−2.764 5（R32=0.999 8），线性范围为2.320 3～74.250 μg/mL。

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 精密度考察 取同一批佛手粉末（S6），按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件，连续进样6 次测定。计算得到橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭峰面积的RSD 值分别为3.19%、2.16%、1.75%，均小于4%，说明仪器的精密度良好。

2.1.5.2 样品稳定性考察 取同一供试品溶液（S6），分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h 后，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定。计算得到样品中橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭峰面积的RSD 值分别为0.67%、1.73%、1.47%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.5.3 重复性试验 取同一批次（S6）供试品粉末6份，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定，计算供试品中橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭的峰面积，得到橙皮苷、6，7-二甲氧香豆素、莨菪亭的质量分数分别为740.47、44.71、51.46 μg/g，RSD 值分别为1.72%、4.24%、4.22%（n=6），表明方法重复性良好。

2.1.5.4 加样回收率试验 精密称取已知3 种成分质量分数的佛手粉末0.5 g，共6 份，按照1∶1 的比例分别加入橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定，计算得到加样回收率分别为：橙皮苷92.28%（RSD 值1.29%）、6，7-二甲氧基香豆素101.54%（RSD 值1.85%）、莨菪亭105.17%（RSD值1.90%），表明本方法具有良好的回收率。

2.1.6 质量分数测定 分别取表1中的佛手生品、制品粉末60 批，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样分析，每个样品重复测定3次，记录各样品的峰面积，采用外标法计算样品中3 种成分的质量分数，结果见图4。结果显示，佛手炮制后6，7-二甲氧基香豆素、莨菪亭质量分数都有不同程度升高，其中6，7-二甲氧基香豆素的升高有统计学意义（P＜0.01）；而橙皮苷质量分数的降低亦有统计学意义（P＜0.01），可能是佛手蒸制后橙皮苷会水解转化为其苷元橙皮素，而致其含量下降。

图4 佛手生品、制品中3种成分的质量分数测定结果Figure 4 The contents of three components in the raw and processed Citrus Medica（n=30）

2.2 基于机器视觉技术的佛手生品、制品样品的图像采集与处理

2.2.1 拍摄参数设置 手动对焦模式，光圈F/8，快门速度1/60 s，IOS 200，图像色彩为RGB 模式，分辨率为4 000×4 000，图像保存格式为jpeg格式。在灯箱底部的正中央放置1 张白纸，将饮片置于白纸上，以减少背景颜色的干扰；采用三脚架固定镜头角度垂直向下以防止角度偏移或拍摄过程中抖动引起饮片图像失真。

2.2.2 目标区域选择 RGB色空间中，纯黑色（R=0，G=0，B=0）背景能最大限度地减少背景的干扰，因此对饮片图像进行前景与背景的分离。采用Matlab 中的Image segmenter 工具箱对佛手生品和制品的饮片图像进行目标区域选择，结果如图5 所示。图像勾画前的红色框为软件自动识别饮片主体部分，蓝色部分是在勾画前景后计算机通过学习所识别到的前景区域，通过勾画背景色对背景进行自动识别，然后将背景部分的颜色替换为黑色。

图5 佛手生品目标区域选择前后的图像Figgure 5 The image before and after selecting of Citrus Medica target region

2.2.3 颜色特征的提取和转化

2.2.3.1 RGB 色空间特征值 RGB 色空间是在数字图像处理的颜色模型中最基本的一种模型，这个模型中其他颜色都是由红色、蓝色、绿色3种颜色相互叠加而形成。其中，R（red，红色）、G（green，绿色）、B（blue，蓝色）为RGB 色空间3 条坐标轴，在量化后所得的数值范围为0～255，其中0 值为颜色最暗时的数值，255 为颜色最亮时的数值[12]。本试验使用Matlab 软件对图片颜色特征进行提取，提取使用的代码参考前期课题组编写的代码，最终得读取的饮片图像的R、G、B颜色值。

2.2.3.2 L*a*b*色空间特征值 在L*a*b*色空间中通过L*值、a*值和b*值来表示颜色在色空间中的位置。其中L*为颜色的亮度；a*和b*为颜色通道，a*为红绿轴，正值表示红色，负值表示绿色；b*为黄蓝轴，正值表示黄色，负值表示蓝色。由于RGB 颜色空间对颜色认知属性的表达不直观，且无法从2 种颜色的空间几何关系中得到它们的认为知觉差异，而Lab空间所计算处理颜色的偏差程度跟人们的主观感受相似，所以需要将试验所得的佛手生品和制品的饮片图像从RGB 模型转换成L*a*b*模型。但RGB颜色空间无法直接转换成L*a*b*颜色空间，所以需要借助三刺激值XYZ 作为过渡，先将RGB 颜色空间转换成三刺激值XYZ，再转换为L*a*b*颜色空间[13]。该转换过程所用的转换公式参考前期课题组编写的转换公式[14]，最终得到L*、a*、b*值。

2.2.3.3 HSV 色空间特征值 HSV 色空间是一种与设备无关的，能将色调（H）、饱和度（S）和亮度（V）分离的颜色空间。其中，色调是色彩的基本属性，其取值范围为0°～360°；饱和度为颜色纯度，取值范围为0%～100%；亮度值表示颜色亮度，取值范围为0%～100%。HSV 模型可由RGB 模型转换，其转换是非线性的[15]。该过程的转换公式参考前期课题组编写的转换公式[14]，最终得到H、S、V值。

2.2.4 机器视觉技术的精密度和稳定性考察 取佛手样品（S3）饮片1 片，按“2.2.1”项下拍摄参数在同一时间点内连续拍摄6次考察机器视觉技术的精密度，连续6 d 在同一时间点拍摄考察机器视觉技术的稳定性，并按“2.2.2”项下图像预处理和“2.2.3”项下图像颜色特征提取方法提取颜色特征。9 个颜色特征值的RSD 值均小于3%，表明机器视觉技术的精密度、稳定性良好。

2.2.5 佛手炮制前后样品的颜色测定 为保证样品的代表性和均匀性，在对佛手生品和佛手制品进行颜色测量时，选择在每批次中随机抽取24片饮片按“2.2.1”项的拍摄参数进行拍摄，共获取1 440 张样品图像。将获得的饮片图像按照“2.2.2”项下图像预处理和“2.2.3”项下方法提取其颜色特征值，结果见表2。在RGB 颜色空间中，佛手在经过炮制后R、G、B3 个特征值均降低，这也造成了佛手炮制后外观明亮度的降低，即在L*a*b*颜色空间中L*和b*的值也相应降低，这与佛手炮制后外观颜色从浅黄色或浅棕色变成深褐色或黑色相吻合。a*值相对变化较小，说明红绿色有轻微变化，颜色向少绿多红的方向轻微偏移，而b*值减小量较大，说明黄蓝色的组成发生较大的变化，颜色向少黄多蓝的方向偏移，说明佛手在炮制后受黄蓝色的变化影响较大。在HSV 颜色空间中，佛手炮制后H值降低的变化较大，说明图像中的色调变化较大，佛手在炮制后由浅棕色变为深褐色甚至黑色，变化较大，也因为这个原因，S值即饱和度也随着颜色的加深而增大。与S值的变化趋势相反，明亮度V随着颜色的加深而减小，这可能是颜色加深使得样品黑色面积增大而导致。

表2 佛手炮制前后的颜色特征值测定结果Table 2 Results of color characteristic values before and after processing of Citrus medica（n=720）

2.3 基于机器学习的佛手生品与佛手制品的颜色定性判别分析

2.3.1 PCA 模型的判别分析 将佛手生品和制品的颜色特征值进行归一化处理作为输入变量，建立基于颜色特征的PCA 模型判别。获得2 个主成分因子：分别从数据差异性最大和次大的方向提取出来，称为主成分1（principal component 1, PC1）和主成分2（principal component 2, PC2），PC1 的解释程度达到98.6%，模型稳定良好。该PCA 模型的2 种主成分的累计解释变量达到99.43%，见图6。即这2种主成分数能够解释佛手生品和制品样品99.43%的颜色特征，提取的信息具有较好的特征性和代表性。图7为PCA模型得分图，由图可知，佛手的颜色特征在炮制前后具有高度分离的趋势，没有重合的部分。同时发现制品较生品的颜色特征分散，代表制品的类趋（class potential）跨度较大，可能是制品颜色较深，不同样品的个体之间的炮制程度存在差异，颜色差距也相对较大而导致；而生品的点较为集中，部分点存在重合现象，可能是生品颜色较浅，为浅黄色或浅棕色，不同样品的个体之间颜色特征差别不大的原因。PCA模型得分图表明将颜色特征数值化客观化来鉴别佛手生品和制品具有一定的可行性，但仍存在一定的误差，后续实验将采用有监督模式识别方法提高判别的准确率。

图6 PCA模型前6个主成分的解释变量与累计解释变量图Figure 6 Explanatory variables and cumulative explanatory variables of the first 6 principal components of PCA model

图7 佛手与制佛手PCA模型得分结果Figgure 7 Score results of PCA model of Citrus Medica and Steamed Citrus Medica

2.3.2 有监督模式识别的佛手炮制前后的判别 为提高模型对佛手炮制前后的判别效果，基于样品图像提取的颜色特征值，采用有监督模式识别方法，包括LDA、PLS-DA、SVM3 种有监督的模式识别方法。以佛手生品和制品样品的9 个颜色特征数值（R、G、B、L*、a*、b*、H、S、V）作为自变量。以佛手的生品、制品作为因变量建立判别模型，使用10 折交叉验证法评价判别模型的性能。10 折交叉验证法是将原始数据集随机划分为样品数量近乎相近的10个子集，轮流将其中的9个子集合并成训练集，而剩余的1 个子集作为测试集，在每次试验中计算正确率等评价指标，最终通过10次试验后取试验所得的评价指标的平均值来评估该模型的泛化能力的验证方法[16]。本次试验共有佛手生制样品60 批，按2∶1 的比例随机划分训练集和验证集，得到训练集40 批（生品的17 批和制品的23 批）与验证集20 批（生品的13批和制品的7批），训练集用来训练模型，从而选出模型的最佳参数；验证集用于测试模型的应用效果。本实验所用的3个判别模型的验证结果如表3 所示，从识别结果可以看出其对样品的识别效果均良好，训练集在训练时对学习佛手生品和制品之间颜色特征值的规律效果较好，正确判别率均为100%，且验证集的正确判别率也为100%。由此可见，LDA、PLS-DA、SVM3个模型均可以对佛手生品和制品的颜色特征值进行快速且准确的鉴别。

表3 LDA、PLS-DA和SVM判别模型识别结果Table 3 Identification results of LDA，PLS-DA and SVM discriminant models

2.4 基于机器学习的佛手炮制前后的颜色-成分相关性分析

使用SPSS 软件机器视觉所测定得到的9 个颜色特征值与佛手生品和制品的3种成分质量分数进行Pearson 相关性分析，结果见表4。结果显示橙皮苷和6，7 二甲氧基香豆素与9 个颜色特征值间的Pearson 相关性均大于0.4，相关性良好，而莨菪亭与9个颜色特征值间的Pearson相关性均小于0.4，说明其相关性较弱。其中，橙皮苷质量分数与R、G、B、L*、b*、H、V这7 个特征值均具有显著差异性，除与a*、S这2个特征值呈负相关外，其余均为正相关，说明一定程度上R、G、B、L*、b*、H、V值减小，橙皮苷质量分数降低，而a*、S值减小，橙皮苷质量分数反而升高；6，7-二甲氧基香豆素的质量分数与R、G、B、L*、b*、H、V这7 个特征值呈负相关，说明一定程度上R、G、B、L*、b*、H、V值减小，6，7-二甲氧基香豆素质量分数升高。Pearson 相关性分析说明炮制前后佛手饮片的颜色变化与上述3种成分的质量分数变化有关，揭示了佛手炮制前后化学成分质量分数与其颜色的动态变化过程。

表4 佛手炮制前后的图像颜色特征值与有效成分的Pearson相关性分析结果Table 4 Results of Pearson correlation analysis between color characteristic values and active components of the image before and after processing of Citrus Medica

3 讨论

根据药材的外观性状特征来综合判断药材的真伪优劣是一种具有中医药特色的质量评价体系，这种质量评价体系被著名中药学家谢宗明先生概括为“辨状论质”，是中药传统质量评价的精髓[17]，说明了中药外观性状特征评价在中药质量评价方法中的重要性。而机器视觉和传统经验比较，其在客观量化形色方面有一定优势，是对传统经验鉴别的一种有益补充[18]。本文以佛手生品与佛手制品为研究对象，通过图像处理技术实现对饮片外观颜色的客观量化，通过研究确定佛手炮制前后的颜色特征及其颜色特征值范围。其中符合传统经验鉴别的佛手生品的颜色特征范围为：R（187.047～209.077）、G（152.648～183.082）、B（113.791～150.143）、L*（65.768～76.067）、a*（2.932～9.969）、b*（13.799～26.313）、H（30.630～34.890）、S（20.737～40.416）、V（73.352～82.265）；符合《广东省中药饮片炮制规范》的佛手制品颜色特征值范围为R（43.642～136.578）、G（30.153～92.509）、B（27.235～64.834）、L*（12.923～43.443）、a*（6.102～15.724）、b*（4.642～23.341）、H（10.246～22.856）、S（34.491～58.781）、V（17.115～53.560）。并通过HPLC 法测定3 种成分的质量分数，探究佛手与蒸佛手外观颜色与有效成分的相关性。结果表明LDA、PLS-DA 和SVM 模型在外部验证中正判率均达100%，可以实现对佛手生品和佛手制品的快速、准确鉴别。通过颜色与质量分数之间的相关性分析，发现橙皮苷质量分数与R、G、B、L*、b*、H、V值呈显著正相关性，与a*、S值呈显著负相关；6，7-二甲氧基香豆素的质量分数与R、G、B、L*、b*、H、V值呈显著的负相关性。初步证明了佛手炮制前后化学成分质量分数与其颜色的动态变化过程，确定了佛手中有效物质成分的质量分数与外观颜色存在相关性。综上所述，机器视觉系统可为佛手及其他中药饮片的质量鉴别及炮制程度的控制提供一种快速、简单、高效的质量检测方法，可为批量大生产和智能化生产提供科学分析依据。