农田土壤中生物炭定量方法研究进展

谢彦海，陈翰博，高玉蓉，陆扣萍，王海龙

（1.佛山科学技术学院 食品科学与工程学院，广东 佛山 528225；2.佛山科学技术学院 环境与化学工程学院，广东 佛山 528000；3.浙江农林大学 资源与环境学院/碳中和学院，浙江 杭州 311300）

生物炭还田是实现农田土壤固碳的有效措施。生物炭施入土壤后，大部分芳香性碳在土壤中极为稳定，但仍有少部分不稳定碳如脂肪族碳、氧化态碳会迅速矿化［1］。目前生物炭的稳定碳汇贡献尚未得到有效核定，对农田土壤中生物炭的定量方法研究仍处于起步阶段。在大田土壤中，通过测定生物炭在土壤中的残留量可直观地反映其固碳效果，对研究其稳定性、空间迁移规律和对土壤有机质的影响具有重要意义。广义上，生物炭属于黑炭类物质的一种，因此本文基于土壤中黑炭的定量方法，综述了现有的适用于生物炭的4 大类定量方法，包括热氧化法、化学氧化法、苯多羧酸分子标记法和光学法，如图1 所示，并比较了各种定量方法的优缺点，旨在为研究者快速准确地选择生物炭定量方法提供一定的技术参考。

图1 土壤生物炭定量方法

1 土壤生物炭定量方法

1.1 热氧化法

如图2 所示，热氧化法主要包括烧失法、热重-差示扫描量热法、化学热氧化法和加氢热解法。该类方法利用生物炭与非生物炭有机碳、无机碳在热稳定性方面的差异进行定量［2-3］。主要有两种形式：一是将包含生物炭在内的所有碳质材料热氧化，通过损失重量来推测生物炭在土壤中的含量。二是把所有非生物炭的有机碳热氧化，而使大部分生物炭得以保留，最后进行碳元素分析［4］。

图2 热氧化法

烧失法最初用于测试土壤有机质，KOIDE 等［5］将其改进用于土壤生物炭定量，该方法使用带有控温系统的马弗炉加热纯生物炭、纯土壤和生物炭及土壤混合物，将3 类样品中的所有有机和无机碳全部热氧化，通过氧化前后的质量损失来估算生物炭含量（纯生物炭烧失量=生物炭及土壤混合烧失量-纯土壤烧失量）［5-6］，纯生物炭与纯土壤烧失量可以在生物炭施入土壤前分别测得，或施入后从土壤中分离两者进行测试［7］。热重-差示扫描量热法通过识别热氧化过程中各类物质在质量和热流量上的差异来区分土壤中不同组分。其中，热重分析仪可记录各温度段下的不同组分的质量损失［3］，而差示扫描量热仪能够识别加热时生物炭产生的特殊放热峰，且峰的相对高度即热流量与样品中的生物炭含量呈显著线性正相关关系［8］，结合热重特征和放热峰曲线可以较为精确地区分生物炭和土壤有机碳，并推导出其含量［9-10］。化学热氧化法实质是化学氧化法与热氧化法的联用，但以热氧化为主，其中Chemical Thermal Oxidation-375 是第1 个广泛应用于土壤中黑炭量化的化学热氧化法［11］，CTO-375 一般在285～375℃有氧条件下进行2～24 h 的热氧化处理以除去土壤中非生物炭的有机碳，随后采用盐酸等弱酸原位去除土壤无机矿物，最终残余物被收集用于全碳分析［12］。加氢热解法是在高压氢气环境下，辅以硫化钼催化剂进行慢速热解，将不稳定有机碳完全分解，并使用元素分析仪对最后残留物进行总碳定量［13］。

1.2 化学氧化法

化学氧化法利用土壤中各组分的不同化学稳定性，使用化学氧化剂去除土壤中的非生物炭组分［2］，如图3 所示，主要包括3 个步骤：无机矿物去除、有机碳氧化和碳元素测定。根据使用氧化试剂的不同，化学氧化法还可分为：重铬酸钾法、过氧化氢法、硝酸法和次氯酸钠法。

图3 化学氧化法

重铬酸钾法由LIM、CACHIER［14］和SONG 等［15］最先用于检测土壤和沉积物中的黑炭，其与测定传统土壤有机质的重铬酸钾外加热法不同的是，该方法在去除矿质后，使用更低浓度的重铬酸钾-硫酸混合溶液和更温和的加热条件，仅将非生物炭有机碳氧化，最后对干燥的氧化残余物进行碳元素分析或13C 核磁共振测定［15-17］。过氧化氢是去除土壤有机碳的有效氧化剂，也常用于生物炭稳定性测试，但在生物炭定量中难以去除芳香缩合度较高的干扰物质［18-19］。硝酸法由KURTH 等［20］提出后经MAESTRINI and MIESEL［21］改进完善，其采用弱硝酸氧化土壤中的非生物炭有机碳，但未得到广泛应用。次氯酸钠法使用次氯酸钠与醋酸混合溶液氧化有机碳，用超纯水洗去盐分，最后通过元素分析或13C 核磁共振测定生物炭含量［22］。

1.3 苯多羧酸分子标记法

苯多羧酸（Benzene Poly-Carboxylic Acids，BPCAs）分子标记法最初由GLASER 等［23］开发，用于土壤与沉积物中黑炭的量化，该技术已得到广泛使用并逐步改进完善［24-25］。该方法利用硝酸在高温高压条件下将含生物炭土壤中所有有机碳消解，随着生物炭稠环芳烃的裂解，与不同个数的羧酸基团结合氧化形成BPCAs 分子，BPCAs 分子的特殊结构可作为量化生物炭的分子标记物［23-24］。与越多的羧基结合，苯多羧酸分子结构越复杂，芳香缩合度越高，则其标记的可靠性也相应提升。

如图4 所示，根据最终检测方式的不同，分子标记法可分为气相色谱法、液相色谱法和元素分析法3 种。气相色谱法主要包括5 个步骤：酸消解、氧化、净化、衍生化以及气相色谱仪与火焰离子化检测器连用（Gas chromatography-Flame ionization detector）测定BPCAs 含量［23，26-27］。生物炭并不能被完全氧化为BPCAs 分子，尤其是制备温度较高（＞800℃）的生物炭，因此BPCAs 总量需乘以转换系数2.27 得到生物炭含量［12］。在气相色谱法的基础上，DITTMAR［28］开发了一种利用高效液相色谱仪与二极管阵列检测器相结合（High-performance Liquid Chromatography-diode Array Detection）的分析技术，该技术多被用于海洋中溶解性黑炭的定量。其省略了气相色谱法耗时的衍生化和各种清洗过程，降低了人工处理带来的误差，被证明是一种更准确、更快速的生物炭定量方法［27，29］，近年来该方法也被用于土壤中黑炭的定量［30-31］。尽管气相色谱法和液相色谱法的回收率相对较高、变异系数较小，但该类方法需昂贵且专业的仪器和耗时繁琐的操作步骤，不适于常规分析大量土壤样品。因此，KOSCHKE 等［32］和LLORENTE 等［33］提出了一种改进的快速元素分析法，即在硝酸氧化和酸洗后，直接使用元素分析仪测量残留物的碳含量，并乘以转换系数，其中氧化前后样品的质量对于定量至关重要。

图4 苯多羧酸分子标记法

1.4 光学法

光学技术常用于生物炭形态的表征，基于生物炭与土壤各组分间不同的光学性质，如光谱特征、吸光性和透光性等，也能估算生物炭在土壤中所占比例。光学法主要包括中红外光谱法、13C 核磁共振法、显微镜法和热光学反射法/透射法。

中红外光谱法已被广泛用于测定土壤有机碳和其他土壤特性的表征［34］，该方法通过检测芳香键并结合偏最小二乘回归（Partial Least Squares Regression）的多元数据分析技术来预测生物炭含量，然而这多适用于半定量研究［4，35-36］。固态13C 核磁共振技术可在分子尺度上识别不同碳源官能团的相对比例，核磁共振信号的峰值强度与各种碳源的化学位移呈正相关关系，因此可以提供有关生物炭芳香结构的定量信息［37］，但核磁共振多与化学氧化法相结合［22，38］。显微镜法应用于土壤样品中生物炭颗粒的计数和分布估算，需根据其粒度选择适宜的显微镜，如光学、扫描电子或透射电子显微镜，并借助网格计数托盘进行观察，最后通过相对面积推断生物炭在土壤中的分布情况［39-40］。热光学反射法/透射法通过监测加热过程中滤光片上样品的反射率或透射率，获得土壤有机碳和生物炭的吸光特性，最初被广泛用于大气气溶胶中碳含量的测定［41］，HAN 等［42］将其应用于土壤或沉积物中生物炭的测定，该方法先在纯氦气氛围下持续升温将非生物炭有机碳热解，剩余稳定的黑炭组分在2%氧气与98%氦气氛围中，550℃、700℃和800℃温度下也被分解，最后均被还原为甲烷并通过火焰离子检测器测定，同时获得所有碳组分裂解时的反射率和透射率。

2 土壤中影响生物炭定量的潜在干扰物质

土壤中干扰定量的物质主要包括传统的土壤有机质如动植物残体及其降解产物腐殖质、非生物炭耐火性有机物和土壤矿物等［43-44］。这些含碳物质、无机矿物的成因虽与热解碳不同，但具有相似的结构和特性，例如高含碳量、高芳香性、低明度等［45］，这类物质的存在会造成生物炭含量的高估。同时，在排除干扰物质的过程中，过度氧化可能也会造成生物炭损失而引起低估。

在涉及热氧化的方法中，部分动植物残体等有机质在升温过程中炭化，形成新的炭化产物是造成生物炭含量高估的因素之一［2，22］。木质纤维素、半纤维素等植物分解底物结构复杂，具有疏水性和芳香性［46］，降解过程缓慢，是土壤中相对稳定的有机碳。腐殖物质占据土壤有机质80%以上，包括富里酸、胡敏酸和胡敏素，这些腐殖质包含大量芳香成分［47-49］。若去除不完全，易被视为生物炭组分。

自然界中的非生物炭耐火性有机物包括类黑素、页岩（干酪根）和煤炭等。类黑素是美拉德反应形成的一种结构复杂、耐降解的高分子聚合物，由碳水化合物与氨基化合物如氨基酸、蛋白质等在加热条件下通过缩合作用形成［45］。类黑素与天然有机质具有相似的化学成分，极易在有机质加热过程中形成，具有较高的芳香度，易被视为生物炭组分，对涉及热氧化的定量方法影响较大。页岩是一种在世界范围内广泛分布的沉积岩，其中碳质页岩、黑页岩有机质含量较高，在经过长时间的风化、搬运作用后成为土壤的一部分［50］，页岩中的干酪根是其有机碳的主要成分，是一种分散在沉积岩中的难溶性大分子有机质，与矿物紧密结合，具有良好的生物化学稳定性和一定的芳香性，与生物炭等黑炭类物质有类似的特性［45，47，51］。煤炭天然存在于较深的地层和少数地表土壤中［52］，与干酪根类似，包含的地质成因有机碳也具有高碳含量、芳香性结构、高芳香缩合度等特点，在颜色、H/C、O/C 以及NMR 图谱等方面，煤炭，尤其是烟煤和褐煤，与富含黑炭的材料非常相似［45，47］。在许多临近工业生产、煤矿开采复垦的农田土壤环境中，土壤中可能存在的煤炭颗粒会影响生物炭的定量。对于靠近城市道路的农田土壤，煤焦沥青路面磨损后形成的沥青和煤焦油颗粒容易被风、地表径流等带入土中，也会引起生物炭估量的偏差［53］。

多数定量方法对土壤无机矿物都较为敏感，尤其是土壤碳酸盐和硅酸盐［54-55］。碳酸盐是碳酸根与金属离子结合的盐类，是土壤无机碳的主要成分，土壤中的碳酸盐会被错误地识别为生物炭，与碳酸根结合的金属离子如Ca2+、Mg2+、Fe2+也会给定量带来一定误差。土壤有机质易与硅氧四面体结合形成包裹有机物的有机-矿物复合体，在这种矿物的保护下，硅酸盐矿物夹层中包裹的有机物抗氧化性能增强，这不利于土壤有机碳的去除［56-57］。

3 不同定量方法的优缺点

如表1 所示，热氧化法、化学氧化法、苯多羧酸分子标记法、光学法这4 大类定量方法优缺点各异，可根据生物炭性质、具体环境介质特点和现有试验条件进行选择或联用。

表1 不同定量方法优缺点

烧失法对仪器和试剂等试验条件要求最低，仅需马弗炉和电子天平，操作步骤简单，测试回收率的斜率接近1（0.960）［5-6］。但烧失法的局限性是需获得纯土壤和纯生物炭样品的烧失率，这意味着要分离土壤和一定数量的生物炭，这在耕作后的农田土壤中难以实现，虽有研究表明生物炭的烧失率并不会随着其在土壤中的老化而发生改变［5］，但在不同土壤环境、气候条件、甚至更长的自然老化时间下，不同原材料和热解条件制备的生物炭的烧失率能否维持不变有待进一步验证。最后，必须确保烧失法的热解温度足以热降解所有生物炭，这与生物炭自身热稳定性相关。热重-差示量热扫描法土样需求量少，具有快速、操作简便的优点，但在热解过程中，部分物质会转化为气体逸出，回收率一般较低于实际值，需辅以校正系数［9］；其次，不同物质放热峰信号的重叠也会影响定量［8］。加氢热解虽然解决了热氧化法中有机质碳化这一问题，大约87.8%的黑炭能够在加氢热解中得以保留［60］，但复杂的加氢热解装置阻碍了其推广应用。化学热氧化法操作过程简单，受外界影响小，平均回收率在26～86%之间，但多适用于高芳香缩合度的生物炭，如在热氧化过程中没有充足的氧气，极易形成新炭化的有机质干扰定量，此外，该方法可能会过度氧化低温制备的生物炭［2，61-62］。化学氧化法对实验条件要求较低，受环境干扰物质影响小，测定工具简单，成本较低，回收率能达约82%［38］，但多次提取转移和清洗过程可能会损失生物炭颗粒而导致低估。此外，化学氧化法周期过长，操作耗时，当测试大量土壤样品时工作量较大。经研究证实，重铬酸钾与硫酸混合溶液和其他氧化剂相比，对生物炭的消耗最小，同时能氧化大部分非生物炭有机碳［47］。尽管如此，生物炭也并不能完全耐受重铬酸钾的氧化，大概有80%的生物炭能够在氧化中得以保存［20，63］，为了避免过度氧化，试剂浓度、氧化温度和氧化时间还能根据生物炭自身稳定性进行调整。相比于其他方法，苯多羧酸（BPCAs）分子标记法有着更高的回收率，可达90%以上［23-24］，同时能够提供生物炭芳香缩合度等特征信息［64］。其中液相色谱法比气相色谱法稳定性更好，相对于气相色谱法（变异系数16～23%），液相色谱法有着更小的变异系数（<5%）和更高的BPCAs 分子产量。然而，该方法步骤复杂、预处理繁琐，需要特殊设备和精密仪器。此外，其他干扰物质如腐殖酸、干酪根和煤炭等也可能在氧化中形成小部分BPCAs 分子而导致高估［65］，元素分析法虽然便捷，但并未得到广泛应用，仍需大量研究支撑其可行性。显微镜法可直观地观察到生物炭的形态（粒度、表面特征和颗粒分布），但网格计数对于定量大面积土壤中生物炭的分布十分局限，量化结果变异性较大。热光学反射法/透射法是变异性最小的定量方法［62］，但此方法难以区分土壤中生物炭和类黑素、煤炭物质，且样品的明亮度和均匀性也会对该方法造成干扰。中红外光谱法结合偏最小二乘回归分析具有经济快速、不破坏土壤样品的优点，但需要大量的数据支撑。核磁共振法一般与化学氧化法联用，成本较高且无法单独区分生物炭成分。

4 小结与展望

目前，生物炭已普遍用于土壤固碳、土壤改良等领域，但专门用于土壤生物炭的定量方法极少。从实际角度出发，找到精确、便捷并适于常规分析的定量方法将有助于生物炭的应用推广，对更深入地研究生物炭与土壤系统的相互作用也具有重要意义。根据目前研究发展情况，提出以下看法和建议：

（1）在4 类方法中，属于热氧化法的烧失法和化学热氧化法、化学氧化法中的重铬酸钾法以及BPCAs 分子标记法中的元素分析法均具有可观的回收率，无需精密的测定仪器，操作便捷，有较好的改进前景，比较适于常规定量分析。而光学法回收率偏低，多用于半定量研究和表征，其中光谱技术常与其他方法联用，可作为提高定量精度的辅助手段。针对烧失法，需经过长期的土壤定位试验，确定新鲜生物炭与在土壤中经过长时间自然老化后的生物炭的烧失率是否有所不同；重铬酸钾法可通过调整试剂浓度、氧化时间和氧化温度缩短过长的试验周期；BPCAs 分子标记法中改进的元素分析法虽然简化了其繁琐复杂的预处理，回收率与气相色谱法相当，但仍需通过大量试验验证其准确性。

（2）生物炭均匀施入土壤后，生物炭颗粒会在地表径流的冲刷下渗、翻耕和风力搬运等外力作用下发生迁移，在土壤中形成空间异质性。因此，无论选用任何一种定量方法，合理采集土壤样品对定量的准确性至关重要，必须进行全面、均匀、具有代表性的土壤采样。土壤中生物炭的量化实质是有效区分生物炭与土壤中其他影响定量的干扰物质，包括传统的土壤有机碳如动植物残体及其降解产物腐殖质等、非生物炭耐火性有机物和土壤矿物。生物炭精确定量的难点即是将这些干扰物质尽可能去除的前提下减少生物炭自身的损耗。

（3）虽然众多研究者们已开发了多种土壤黑炭定量方法，并都具有较为可观的回收率，但由于黑炭这一燃烧连续体在土壤中的形式复杂多样，加之各类方法对检测黑炭连续体各组分的侧重有所不同，不同方法量化结果差异较大且难以相互比较，目前尚未有统一的标准定量方法。土壤生物炭定量方法研究仍然处于起步阶段，在筛选出合适的定量方法后，应采用标准的参考物质对不同定量方法进行测试，并设置统一的评价指标如回收率、变异系数等进行比较研究，这是未来生物炭量化方法研究的重点之一。