基于Nrf2/HO-1信号通路探讨补阳还五汤对AngⅡ诱导的H9c2细胞铁死亡的保护作用

薛亚楠, 王建波, 曲怡, 高佳馨, 张云雨, 张立德*

(1.辽宁中医药大学中医药创新工程技术中心, 沈阳 110847; 2.中医脏象理论及应用教育部重点实验室, 沈阳 110847;3.辽宁中医药大学研究生学院, 沈阳 110847)

高血压作为常见慢性病,是世界1/4以上成年人(全世界估计有10亿以上成年人)发病和死亡的主要病因[1],中国高血压患者人数已达2.45亿人[2],严重加重了心血管疾病的负担。长期血压升高会导致靶器官疾病,尤其是左心室的病理性改变,最终形成高血压性心脏病而加重心力衰竭、心肌梗死等心血管事件的风险[3]。目前对引起病理性心脏重塑的机制研究尚少,因此进一步研究高血压心脏病发病机制中新的分子靶点十分必要。

铁死亡是最新研究发现的一种铁依赖性、脂质过氧化驱动的细胞死亡级联反应,以铁代谢紊乱和脂质过氧化为中心环节,可通过铁超载和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)失活来激活,已成为心血管疾病发展的关键机制[4]。铁死亡过程中,胱氨酸-谷氨酸反转运蛋白活性受到抑制,即进入细胞的胱氨酸量减少,从细胞外运输的谷氨酸量减少,脂质过氧化物累积[5],然后GPX4失活,导致细胞发生铁死亡[6]。最新研究发现,抑制糖尿病(DM)和心肌缺血/再灌注(I/R)大鼠的铁死亡,可减轻大鼠心肌损伤[7]。依据目前研究来看,抑制铁死亡可能是治疗和预防心脏损伤、减轻病理性心脏重塑和帮助预后的潜在靶向治疗选择。补阳还五汤是益气活血的代表方剂,被临床灵活加减应用于治疗各种类型的高血压病。临床研究证实,应用补阳还五汤能改善高血压患者的血液循环[8],纠正高血压病气虚血瘀证引起的细胞凋亡[9]。课题组前期研究也证明该方不仅可以保护血管内皮功能[10],还可通过抑制AngⅡ/AT1R信号通路的激活,保护高血压心肌损伤[11]。基于以上,现使用血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)构建大鼠H9c2心肌细胞高血压损伤模型,通过细胞检测等手段观察补阳还五汤对Nrf2/HO-1信号通路的调节作用,从铁死亡的角度探讨补阳还五汤对高血压心肌损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

H9c2(2-1)(CL-0089)由武汉普诺赛生命科技有限公司提供。

1.2 药物与制备

补阳还五汤:黄芪30 g,赤芍4.5 g,川芎3 g,当归6 g,地龙3 g,桃仁3 g,红花3 g。以上药物购自辽宁中医悦禾医院,共52.5 g,用52.5 mL高压灭菌水将其完全融化,将所得中药溶液在200 r/min,50 ℃条件下旋转蒸发浓缩后,用真空冷凝干燥机对浓缩后的药物进行冻干处理48 h,制成冻干粉。使用前用超纯水溶解冻干粉制备中药母液,0.22 μm滤器过滤除菌后于-20 ℃冰箱保存待用。

1.3 实验试剂及仪器

AngⅡ(货号:A1042),美国APExBIO公司;Ferrostatin-1(Fer-1)(货号:A4371),美国APExBIO公司;胎牛血清(FBS,Gibco公司);DMEM高糖培养基(货号:CM-0089),武汉普诺赛生命科技有限公司;青链霉素混合液(货号:No.P1400),索莱宝;胰蛋白酶-EDTA消化液(货号:KGY0012),凯基生物;CCK-8试剂盒(货号:KGA317),美国APExBIO公司;Nrf2 Ab-AF0639-50ul(货号:AF0639),Affinity Biosciences;HO-1 Ab-AF0639-50ul(货号:AF0639),Affinity Biosciences;Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(货号:A0423),碧云天;免疫染色强力通透液(货号:P0097),碧云天;细胞铁含量检测试剂盒(货号:BC5315),北京索莱宝科技有限公司;Rat GPX4 Elisa kit(货号:E31103),Andy gene;Rat GSH Elisa kit(货号:E31034),Andy gene。

光谱型激光扫描共聚焦显微镜系统(FV10i);CO2恒温培养箱(Thermos scientific);超净工作台(ESCO);细胞计数仪(LUAII);荧光定量 PCR仪(Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm);梯度 PCR 扩增仪(Applied Biosystems);多功能酶标仪(SpectraMax I3奥地利Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1 H9c2大鼠心肌细胞培养

H9c2细胞在37 ℃、5% CO2、饱和湿度环境下用含10% FBS和1%P/S Solution的DMEM高糖培养基培养。用胰蛋白酶-EDTA消化液消化和传代,选择对数期生长的细胞进行后续实验。

2.2 细胞分组和给药

将传代后的H9c2细胞分为五组:正常组(ZC)、模型组(MX)、补阳还五汤低剂量组(BD)、中剂量组(BZ)、高剂量组(BG)和阳性对照组(YX)。待细胞生长至80%左右时,正常组继续培养,模型组用含1 μmol/L AngⅡ的培养基培养,补阳还五汤低剂量组用含补阳还五汤颗粒0.5 mg/mL及1 μmol/L AngⅡ的培养基培养,中剂量组用含补阳还五汤颗粒1 mg/mL及1 μmol/L AngⅡ的培养基培养,高剂量组用含补阳还五汤颗粒2 mg/mL及1 μmol/L AngⅡ的培养基培养,阳性对照组用含10 μmol/L Fer-1及1 μmol/L AngⅡ的培养基培养,各组培养24 h后弃上清液,进行后续不同实验检测。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 CCK-8法检测细胞活力

对数期生长的H9c2细胞接种至96孔细胞培养板,铺板24 h后按照组别分别予以不同处理,每组10孔,24 h后吸去上清,根据试剂盒说明书使用CCK-8比色法检测H9c2细胞活性(OD值表示)。用酶标仪检测在波长450 nm处的吸光度,每组重复实验3次,计算公式为

Ca=Asample/Acontrol×100%

(1)

式(1)中:Ca为细胞活性;Asample为加样组吸光度值;Acontrol为空白组吸光度值。

2.3.2 细胞铁含量检测

选择对数期生长的H9c2细胞接种于6孔细胞培养板,铺板24 h后按照组别分别予以不同处理,每组2孔,24 h后弃上清,每组加入0.5 mL提取液,冰浴超声波破碎细胞(功率200 W,超声3 s,间隔7 s,重复30次),于4 ℃,8 500 r/min离心10 min后取上清后按照测定步骤操作,用酶标仪检测在波长510 nm处的吸光度,用96孔板测得计算吸光度值差值,每组重复实验3次。细胞铁含量计算公式如下。

CFe=27.922ΔAm/ΔAs

(2)

ΔAm=Am-Ablank

(3)

ΔAs=As-Ablank

(4)

式中:CFe为细胞铁含量,ng/104cell;ΔAm为测定吸光度差值;Am为测定值;Ablank为空白值;As为标准值。

2.3.3 免疫荧光法检测Nrf2蛋白表达

将H9c2细胞以合适浓度接种于共聚焦小皿,待细胞贴壁后按照组别干预处理24 h后,弃培养液,用PBS清洗;加入预冷的4%多聚甲醛固定1 h,PBS清洗;免疫染色强力通透液通透10 min,PBS清洗;5%BSA封闭1 h,加入PBS配制的一抗,4 ℃过夜后PBS清洗,使用PBS配制的荧光二抗避光孵育2 h,PBS清洗后,滴加适量抗荧光衰减封片剂(含DAPI),于激光共聚焦显微镜下拍照。

2.3.4 RT-PCR法检测铁死亡通路相关因子表达

经AngⅡ造模及药物干预处理后,使用Trizol裂解液从细胞中提取总RNA测量RNA浓度和纯度,用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,随后用荧光定量PCR仪进行扩增,β-actin作为内参基因。引物由北京博迈德基因技术有限公司合成,各分子引物序列见表1。

表1 扩增使用引物

2.3.5 ELISA法检测细胞中GSH和GPX4含量

于六孔板中种植H9c2细胞,铺板24 h后按照组别分别予以不同处理后,使用胰蛋白酶消化细胞后,用PBS稀释细胞悬液(细胞浓度达106/mL),通过反复冻融使细胞破坏并放出细胞内成分,3 000 r/min离心20 min后收集上清。按照ELISA试剂盒说明书进行标准操作流程,用酶标仪检测450 nm波长各孔吸光度,计算蛋白表达量。

2.3.6 Western Blot检测细胞中Nrf2、HO-1蛋白表达

于25 mL细胞培养瓶中培养H9c2细胞,待细胞生长至对数期时按照组别予以相应处理24 h后,收集细胞,加入含1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的RIPA裂解混合液提取蛋白,BCA法测定蛋白浓度后进行定量。60 μg蛋白上样后用SDS-PAGE电泳和电转移PVDF膜,使用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后孵育一抗4 ℃过夜,TBST洗涤3次后二抗室温孵育2 h,TBST洗涤3次,用ECL发光试剂盒进行曝光,β-actin作为内参对目的蛋白进行对比分析。

3 统计学处理及结果

3.1 统计学处理

3.2 补阳还五汤对AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞活力的影响

与正常组相比,模型组H9c2心肌细胞活力明显下降(P<0.01);与模型组相比,补阳还五汤中剂量组、高剂量组和阳性对照组细胞活力均有所提升,其中高剂量组和阳性对照组效果显著(P<0.01)。提示补阳还五汤和阳性药物Fer-1能保护AngⅡ损伤的H9c2细胞活力,结果见图1。

a表示与ZC组比较P<0.01;b表示与MX组比较P<0.01;数据以均值±标准差表示;每组实验重复3次

3.3 补阳还五汤对AngⅡ环境下H9c2心肌细胞铁含量的影响

与正常组相比,模型组H9c2细胞铁含量明显增加(P<0.01);与模型组相比,补阳还五汤高剂量组和阳性对照组细胞铁含量均明显减少(P<0.01),补阳还五汤中剂量组未见显著性差异。提示补阳还五汤和阳性药物Fer-1能降低AngⅡ诱导的H9c2细胞内铁含量的表达,结果见图2。

数据以均值±标准差表示;每组实验重复3次

3.4 补阳还五汤对AngⅡ环境下H9c2心肌细胞Nrf2表达的影响

与正常组相比,模型组H9c2细胞绿色荧光值显著降低(P<0.01),说明Nrf2蛋白表达明显下降;与模型组相比,补阳还五汤中剂量组、高剂量组和阳性对照组绿色荧光值均显著增加(P<0.01),说明经药物治疗后H9c2细胞内Nrf2蛋白表达明显增多,且补阳还五汤高剂量组效果优于中剂量组。提示补阳还五汤和阳性药物Fer-1能提升AngⅡ诱导的H9c2细胞内Nrf2蛋白表达的降低,结果见图3和图4。

图3 补阳还五汤对AngⅡ环境下H9c2心肌细胞内Nrf2蛋白表达的影响(荧光图600×)Fig.3 Effect of Buyang Huanwu Decoction on the expression of Nrf2 protein in H9c2 myocardial cells under AngⅡ environment (fluorescence map 600×)

a表示与ZC组比较P<0.01;b表示与MX组比较P<0.01;数据以均值±标准差表示;每组实验重复3次

3.5 补阳还五汤对AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞铁死亡信号通路相关因子表达的影响

与正常组相比,模型组H9c2细胞内GPX4、Nrf2和HO-1的mRNA表达均显著低于正常组(P<0.01);补阳还五汤中剂量组、高剂量组和铁死亡抑制剂组GPX4、Nrf2和HO-1的mRNA表达均显著高于模型组(P<0.01);补阳还五汤低剂量组与模型组相比未见显著差异(P<0.01),结果见图5。

a表示与ZC组比较P<0.01;b表示与MX组比较P<0.01;数据以均值±标准差表示;每组实验重复3次

3.6 补阳还五汤对各组H9c2细胞内GPX4、GSH、Nrf2和HO-1蛋白表达的影响

与正常组相比,模型组GPX4、GSH、Nrf2和HO-1蛋白表达明显减少;与模型组相比,补阳还五汤高剂量组和阳性对照组GPX4、GSH、Nrf2和HO-1蛋白表达显著增高,补阳还五汤低剂量组未见显著差异,但补阳还五汤中剂量组有表达上升趋势,结果见图6。

a表示与ZC组比较P<0.01;b表示与MX组比较P<0.01;数据以均值±标准差表示;每组实验重复3次

4 讨论

高血压病归属于中医学的“眩晕”“头痛”等范畴,气虚血瘀型为临床上较常见证型,气虚血瘀、气血不和而致眩晕、头痛、乏力等症状,故在治疗上以补气、活血通络为主。补阳还五汤作为益气活血的代表方剂被临床灵活加减应用于治疗各种类型的高血压病,这与中医理论体系的基本特点——辨证论治相契合。中医理论认为,人体内部各组织器官不是孤立存在而是相互关联的有机统一整体,任一环节出现问题皆会影响整体生命活动。大量研究证实,高血压继发左心室肥厚患者预后不良,心血管病的发生率是其他危险因素(如年龄、高胆固醇血症、糖尿病等)的2～4倍[12-13],患中风[14]、室性心律失常和心源性猝死[15]的风险也更高,这与中医理论体系的另一基本特点——整体观念相契合。目前已知铁死亡在心肌病、心肌梗死(MI)、缺血/再灌注损伤(IRI)和心力衰竭(HF)中皆起着关键作用。由于铁死亡和铁过量是心肌细胞死亡主重要原因,所以抑制铁死亡是减少心肌细胞死亡和改善心脏病状况的新策略。因此,从铁死亡角度探究高血压性心肌损伤的分子机制对阐释中医药防治高血压性心脏病具有重要意义。

肾素-血管紧张素系统(RAS)在心血管疾病中的作用已得到充分证实,在维持血压稳定、细胞外液容量内稳态和心血管重构中皆起着关键作用[16-18]。RAS失控可导致多种病理条件,主要是动脉血压的升高,通过直接作用于心脏、血管和肾脏等组织,导致靶器官的损伤[19]。AngⅡ作为RAS的主要活性肽,可诱导小鼠的病理性心脏重塑和功能障碍[20],激活AngⅡ受体可诱导血管收缩、内皮功能障碍、炎症等[21]。因此,通过体外培养H9c2大鼠心肌细胞,采用1 μmol/L的AngⅡ诱导H9c2细胞构建高血压性心肌细胞损伤模型,采用10 μmol/L的Fer-1为阳性对照组[22]。结果显示,与正常组相比,AngⅡ诱导的H9c2细胞活性明显降低,铁含量明显升高,补阳还五汤和铁死亡抑制剂Fer-1的使用能缓解AngⅡ引起的H9c2细胞死亡,且铁含量有所下降,提示铁死亡可能参与了AngⅡ诱导的H9c2细胞损伤,补阳还五汤可能是通过抑制铁死亡的途径对心肌细胞损伤起到了保护作用。

谷胱甘肽(GSH)是细胞抗氧化防御中最重要的成分之一,是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的一种简单的三肽。谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)作为维持细胞内抗氧化系统平衡的关键酶[23],主要作用是维持GSH两种类型之间的平衡[24]。细胞通过胱氨酸/谷氨酸反转运体系统xC-/xCT从细胞外环境输入胱氨酸获得半胱氨酸。输入的胱氨酸通过胱氨酸还原酶被还原,被谷氨酸-半胱氨酸连接酶(GCL)和谷胱甘肽合成酶(GSS)用于生成GSH。当胱氨酸/谷氨酸反转运体系统xC-/xCT受到抑制时,细胞内GSH合成减少导致氧自由基堆积而引起细胞发生铁死亡[25]。核因子E2相关因子(Nrf2)是启动内源性抗氧化反应元件的转录因子之一,调控着数百个基因,其中许多基因直接或间接参与调节铁死亡,包括GSH、铁和脂质的代谢以及线粒体功能,几乎所有与铁死亡相关的基因都由Nrf2 转录调控[26]。Nrf2不仅可以诱导细胞GSH增加,还可以通过直接上调GPX4转录保护细胞免受过氧化物生成和铁死亡的影响[27-29]。增强Nrf2的表达可减轻心肌氧化应激对糖尿病心脏起到保护作用[30]。此外,当体内自由基增多时,Nrf2还可以通过活化易位到细胞核并结合到特定的DNA位点应对氧化应激,进而启动下游抗氧化酶如血红加氧酶-1(HO-1)的转录表达防止细胞发生氧化[31],HO-1将血红素降解为胆绿素和亚铁等,通过抗凋亡和抗氧化作用参与到铁死亡的过程而发挥保护心脏的作用[32]。换言之,Nrf2与其下游抗氧化反应元件GSH、GPX4、HO-1等是调节铁死亡和脂质过氧化的重要信号分子[33]。既往研究表明,Nrf2/HO-1信号轴还具有逆转线粒体凋亡的作用,从而减缓疾病进程而作为缓解高血压心脏病的治疗方法[34];瑞舒伐他汀可通过调节Nrf2和Smads之间的相互作用,改善心功能,减少心肌肥厚[35]。然而,高血压继发心肌损伤是否由于铁死亡相关通路被激活尚不明确。

5 结论与展望

采用AngⅡ诱导H9c2细胞构建高血压性心肌细胞损伤模型,研究心肌损伤的机制及补阳还五汤在心肌损伤中的药理作用。结果表明AngⅡ可诱发H9c2细胞铁死亡及相关因子表达的降低。与模型组相比,补阳还五汤高剂量组能明显提升GPX4、GSH、Nrf2、HO-1基因和蛋白表达,从而改善细胞活力,与阳性对照组结果一致;补阳还五汤低剂量组未见治疗效果,中剂量组仅AngⅡ条件下H9c2细胞铁死亡相关通路的基因表达起到了显著效果,蛋白表达未见显著性差异,证实补阳还五汤高剂量组治疗AngⅡ诱导的H9c2细胞损伤效果最佳。由此推测补阳还五汤预防和保护高血压性心肌损伤,其可能作用机制与上调Nrf2/HO-1通路相关因子的表达进而调控铁死亡有关。通过构建体外模型为补阳还五汤对高血压性心肌损伤的保护作用提供了参考资料,但介于补阳还五汤复方中药材的多样性和复杂性,使其作用途径和靶点也不单一,因此该复方是否通过调节铁死亡保护高血压性心肌损伤,仍需进一步实验验证。