乳清浓缩蛋白对松仁蛋白溶解度及其乳液稳定性的影响

刘文超, 杨 凯, 赵玉红,3,*

(1.东北林业大学 生命科学学院, 黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江省林业科学研究所, 黑龙江 哈尔滨 150081;3.黑龙江省森林食品资源利用重点实验室, 黑龙江 哈尔滨 150040)

红松(Pinuskoraiensis)是松属松科植物,又称海松、果松、朝鲜松,是中国珍贵的用材树种之一,产于长白山、小兴安岭天然林中,在俄罗斯、日本、朝鲜、韩国也有分布。红松种子含油脂,“中国红松子”口味好,并有滋补、祛风寒等功效,是传统出口食品,享有美誉。红松的松子仁中蛋白质的质量分数约为16.5%,松二蛋白是一种营养价值较高的植物蛋白,具有氨基酸比例合理[1]、降血糖[2]、抗氧化[3]等优点。目前对松仁蛋白的研究主要集中在制备功能性肽、加工食品、功能性质以及蛋白改性等方面[4-7]。

天然松仁蛋白(pine kernel protein,PKP)乳液的稳定性较差,易出现絮凝、分层等不良现象。PKP的溶解度较差、乳化性能不佳,束缚了松仁蛋白在食品生产中的应用范围。有研究对松仁蛋白进行磷酸化改性,以提高其乳化性[8];然而化学修饰会损坏蛋白的一级结构,可能产生不受欢迎的副产物[9]。也有使用加压、烤制等物理方法提高松仁蛋白功能特性的研究[10-11],但生产工艺复杂、加热蛋白变性等问题依然可能存在。

研究发现,蛋白质-蛋白质相互作用可改善蛋白质的功能特性,如酪蛋白和大米蛋白[12]、小麦面筋蛋白和大豆分离蛋白[9]、大豆蛋白和水稻蛋白[13]等的相互作用,改善了蛋白质的溶解性和乳化性。乳清浓缩蛋白(whey protein concentrate,WPC)具有营养价值高、易于消化、生物利用度高、较高的溶解度和亲水性的特点[14],是制备复合蛋白的较佳选择。Alrosan等[15]研究发现将乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)按照一定的比例添加到小扁豆蛋白中,通过蛋白质复合物分子间作用力(静电相互作用、疏水相互作用和氢键)的作用,小扁豆蛋白的溶解度可提高到90%以上。Wang等[16]在研究水稻蛋白和WPI的相互作用时也发现WPI的加入可使水稻蛋白的溶解性显著提高。李良等[17]采用大豆分离蛋白-WPI作为乳化剂制备水包油型(O/W型)乳液,发现添加WPI后显著改善了乳液的稳定性。其他研究也发现,WPI易与其他植物蛋白相互作用形成复合蛋白,WPI制得的复合蛋白乳液具有良好的乳液稳定性[18-19]。目前,关于松仁蛋白和乳清浓缩蛋白相互作用提高松仁蛋白的溶解度和乳液稳定性的研究尚未见报道。

本研究通过制备可溶性松仁蛋白-乳清浓缩蛋白(pine kernel protein-whey protein concentrate,PKP-WPC)复合蛋白,研究复合蛋白的结构变化,了解松仁蛋白和乳清浓缩蛋白之间相互作用的机制及二者产生稳定O/W型乳液的可行性。希望可为新型蛋白产品的研发提供理论基础,拓宽松仁蛋白在加工食品中的应用范围,推动PKP-WPC双蛋白乳液研究的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红松松子由黑龙江省林科院提供;乳清浓缩蛋白(蛋白质质量分数为78.79%),天津银河伟业进出口有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、β-巯基乙醇,北京索莱宝生物科技有限公司;考马斯亮蓝G-250、尼罗蓝、尼罗红,上海源叶生物科技有限公司;硫脲、氯化钠、8-苯胺基-1-萘磺酸钠(ANS),上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TDL-40B-W型高速离心机,上海恒勤仪器设备有限公司;722型紫外-可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司;FD5-2.5E型冷冻干燥机,北京金西盟仪器有限公司;LS55型荧光分光光度计,美国PE公司;Chirascan V10型圆二色谱仪,英国应用光物理公司上海代表处;90Plus型Zeta电位分析仪,美国布鲁克海文仪器公司;FA25型高剪切分散乳化机,上海欧河机械设备有限公司;90Plus型Brookhaven激光粒度仪,美国布鲁克海文仪器公司;LSM800型激光共聚焦显微镜,北京创诚致佳科技有限公司;AR2000ex型旋转流变仪,美国TA公司。

1.3 实验方法

1.3.1脱脂松仁粕预处理

红松松子手工去壳皮,粉碎机打碎,索氏抽提法去油,通风橱中室温风干,干燥的松仁粕粉碎,过60目筛,4 ℃储存备用。

1.3.2松仁蛋白的提取

参考Yan等[20]方法并略作改动。按m(脱脂松仁粕)∶V(蒸馏水)=1∶10 g/mL的料液比溶解,用1.0 mol/L NaOH将悬浮液调节至pH值为 9.0,在室温下磁力搅拌1 h,4 000 r/min离心15 min,收集上清液。用1.0 mol/L HCl将上清液的pH值调节至4.6,磁力搅拌1 h,4 000 r/min离心15 min,收集沉淀。将沉淀的蛋白质调至中性,冷冻干燥,-20 ℃保存备用。

1.3.3松仁蛋白-乳清浓缩蛋白复合蛋白的制备

参考He等[9]方法并略作改动。在室温下,将1.0 g PKP分散在100 mL去离子水中,获得质量分数为1.0%的悬浮液,分别加入0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g的WPC,制成PKP与WPC质量比为1.0∶0.1、1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0的水溶液。用1.0 mol/L NaOH调节pH值至12.0,磁力搅拌2 h以确保充分水合。水合的蛋白溶液用0.1 mol/L HCl缓慢中和至pH值为7.0,10 000 r/min离心10 min,收集的上清液为复合蛋白原液;使用3 400 Da的透析袋透析24 h以除去多余的盐,冷冻干燥,即为PKP-WPC复合蛋白。除非另有说明,以下表征均用新鲜制备的上清液进行实验。为了进行比较,PKP和WPC与上述样品平行处理,作为对照,与复合物一起进行表征。

1.3.4松仁蛋白溶解度的测定

蛋白质的溶解度采用氮溶解指数(nitrogen solubility index,NSI)表示[21]。将pH循环后的PKP-WPC复合蛋白10 000 r/min离心10 min,收集上清液和沉淀物,凯氏定氮法进行氮测量。松仁蛋白的NSI计算方法见式(1)。

(1)

式(1)中,mp为松仁蛋白的初始质量,g;mk为离心后沉淀物中的蛋白质质量,g。

1.3.5复合蛋白分子质量的测定

参照Mohamed等[22]方法略作修改。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对PKP、WPC、不同复配比例的复合蛋白的蛋白质分子质量进行鉴定分析。取样品溶液,用去离子水稀释至质量浓度为5.0 mg/mL,按1∶1的体积比加入上样缓冲液,100 ℃下煮沸5 min。上样量为20 μL,分离胶质量分数为12%,浓缩胶质量分数为5%。开始电压为80 V, 进入分离胶后为120 V,电泳时间约2.5 h。电泳后,用考马斯亮蓝R-250染色。离心后产生的沉淀也通过SDS-PAGE进行检测。

1.3.6复合蛋白结构的测定

1.3.6.1 内源性荧光光谱的测定

参考He等[9]的研究方法采用荧光分光光度计测定蛋白质的三级结构变化。分别用pH值为12.0、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0的去离子水将样品溶液质量浓度稀释至0.01%,使用荧光分光光度计在280 nm的激发波长下获得300～450 nm波长范围内的荧光光谱。狭缝宽度为10 nm。

1.3.6.2 紫外-可见光谱的测定

参考Wang等[12]的研究方法采用紫外-可见光谱测定蛋白质的立体构象变化情况。分别用pH值为12.0、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0的去离子水将样品溶液质量浓度稀释到0.01%。使用紫外-可见分光光度计在波长为190～350 nm处获得蛋白质溶液的紫外光谱。

1.3.6.3 圆二色谱的测定

参考Wang等[16]的研究方法采用圆二色谱仪测定蛋白质的二级结构变化。将复合蛋白溶液分别用pH值为12.0、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0的去离子水将质量浓度稀释至0.5 mg/mL。波长为190～250 nm,使用0.1 cm的石英比色皿,扫描参数为:步长0.1 nm,平均时间2 s,平均扫描3次。蛋白质二级结构含量通过与已知构象的蛋白质数据库的光谱线性拟合进行计算。

1.3.7复合蛋白表面性质的测定

1.3.7.1 表面疏水性的测定

用ANS作为荧光探针测定蛋白质的表面疏水性[23]。用浓度为10 mmol/L的PBS缓冲液(pH=7.0)制备质量浓度为0～2 mg/mL的样品溶液。将3 mL样品溶液与30 μL浓度为 8.0 mmol/L ANS溶液混合。激发波长为390 nm,发射波长为470 nm,记录荧光强度,激发和发射狭缝宽度为10 nm。

1.3.7.2 ζ-电位的测定

参考Yan等[24]的方法略作修改,采用ζ-电位分析仪测量蛋白质溶液的ζ-电位,上样体积为1 mL,温度平衡时间为2 min。测试条件为:温度为25 ℃、散射角为173°、蛋白质和分散介质的折射率分别为1.45和1.33、电导率范围为 0～200 ms/cm。

1.3.8乳液的制备

参考Turan等[25]的方法略作修改,以蛋白溶液为原料,分别模拟牛奶、冰淇淋和奶油的含油量,制备油相体积分数为3%、10%和50%的乳液。将所需量的大豆油和蛋白溶液混合,于高剪切分散乳化机16 000 r/min处理3 min,每隔20 s停顿1次,得到最终的乳液。

1.3.9乳液性质的测定

1.3.9.1 乳液平均粒径的测定

参考Shao等[26]的方法,采用Brookhaven激光粒度仪测定乳液的平均粒径。样品乳液用质量浓度为10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)稀释100倍,以避免多重光散射效应的影响。分散介质为水,颗粒折射率为1.46,分散介质折射率为1.33,吸收参数为0.001,测试温度为25 ℃。

1.3.9.2 乳液ζ-电位的测定

参考Shi等[27]的方法略作修改。样品乳液用质量浓度为0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)稀释100倍。测定方法参考1.3.7.2节。

1.3.9.3 乳液乳层析指数的测定

参考Benetti等[28]的方法测定乳液乳层析指数。室温条件下将制备好的样品静置10 d,分别在第0、1、3、7、10 天的同一时刻记录乳液在比色管分层界面的刻度,用以衡量乳液分离的程度。乳层析指数(CI)的计算见式(2)。

(2)

式(2)中,HC为清液高度,cm;HE为乳液总高度,cm。

1.3.9.4 乳液微观结构的测定

参考Zhang等[18]的研究方法采用激光共聚焦显微镜测定乳液的微观结构。将20 μL质量分数为1%的尼罗蓝和20 μL质量分数为0.1%的尼罗红染液混合,吸取1 mL乳液样品与40 μL混合染液避光染色30 min。将10 μL染色乳液样品滴到载玻片上,用盖玻片覆盖。使用10倍放大透镜观察样品,利用Ar/Kr和 He/Ne双通道激光模式采集图像,对于蛋白质和油,氩-氪和氦-氖激光激发波长分别为488 nm和633 nm。

1.4 数据处理

所有实验重复3次。组间差异显著性采用t检验分析(P<0.05),数据统计分析采用SPSS 20.0软件,用Origin 2018、Excel软件绘图。

2 结果与分析

2.1 松仁蛋白溶解度分析结果

通过在pH 值为12.0条件下共溶PKP和WPC,并在pH值为7.0条件下重新收集,制备了可溶性复合蛋白。PKP的NSI大致计算为溶解在溶液中的PKP质量与反应中使用的初始PKP质量的百分比,实验结果见图1。由图1 (a)可知,PKP(对照)的溶解度为48.53%,添加WPC后,溶解度显著提高,当PKP与WPC质量比为1.0∶1.0时,PKP的溶解度为92.43%。减少乳清浓缩蛋白添加量会导致蛋白质混合物显著沉淀,而乳清浓缩蛋白添加量的进一步增加不会显著改变PKP的溶解度。这一现象与Wang[12]研究的添加酪蛋白对水稻蛋白的溶解度的影响一致。值得注意的是,制备的复合蛋白可以完全溶解在水中 [图1 (b)]。以溶解度为评价指标,最终选择了PKP与WPC质量比为1.0∶1.0的比例进行后续实验。

图1 WPC对PKP溶解度的影响Fig.1 Effect of WPC on solubility of PKP

2.2 复合蛋白分子质量分析结果

用SDS-PAGE研究了蛋白质亚基对复合蛋白形成的贡献,结果见图2。由图2可知,几乎所有的WPC亚基都溶解在上清液中,并在与PKP相互作用后进一步收集,因此,WPC的不溶性亚基的数量可被忽略;PKP在23、33、53 kDa处有显著的蛋白条带,这与Adelina[29]观察到的PKP亚基条带一致。WPC(第3条通道)的电泳图显示,在16 kDa和66 kDa处有清晰的亚基条带,Wang等[16]在研究WPI的电泳图时也看到了类似的条带。通过以不同的比例将PKP和WPC构建成复合物,PKP和WPC的亚基条带清晰地呈现在通道4～8中,表明复合蛋白完整保留了2种蛋白质的亚基。随着WPC添加量的增加,16 kDa处的条带因其更多地并入PKP而变得更加明显。Wang等[13]也报道过类似的结论,复合蛋白含有来自2种原始蛋白质的蛋白质亚基,其分子质量没有显著变化,表明本研究中的pH循环诱导的蛋白质-蛋白质相互作用能有效保证2种蛋白质的分子完整性。

通道1～3分别为 Marker、PKP和WPC,4～8表示PKP与WPC质量比分别为1.0∶0.1、1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0构建的复合蛋白。

2.3 复合蛋白结构分析结果

2.3.1内源性荧光光谱分析结果

对中和至pH值为 7.0的复合蛋白进行荧光光谱分析,以证明PKP和WPC之间的蛋白质-蛋白质相互作用,这可以区分这种结构反应与两种蛋白质的简单混合,实验结果见图3。由图3(a)可知,PKP和WPC在338 nm处都有一个明显的峰值强度(Fmax),这是色氨酸的主要发射。PKP在280 nm激发下具有较高的Fmax,然而,添加WPC后,该峰强度基本上被猝灭,大量研究证实,蛋白质与外来物质的相互作用明显地淬灭了蛋白质的固有荧光[30],这表明PKP和WPC是相互作用的。随着酸化过程的进行,Fmax逐渐增大 [图3 (b)],表明蛋白质被还原成更高阶构象。最终,荧光强度在pH值为 7.0时达到顶峰,但仍然远低于对照PKP,表明PKP与WPC相互作用发生三级结构变化,PKP的结构复性受到WPC的抑制。

图3 蛋白样品的荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectra of protein samples

为了探究形成复合蛋白所参与的具体非共价作用力,在pH循环之前向样品中添加NaCl、硫脲和SDS三种阻断剂。上述阻断剂的不同处理导致蛋白质复合物之间或内部不同分子力的破坏,并且可以通过荧光发射光谱反映出来。由图3 (c)可看出,富含NaCl的反应蛋白溶液的荧光强度最高,其次是富含硫脲和SDS的反应蛋白溶液,这表明在PKP-WPC复合蛋白中,静电力是主导力,其次是氢键和疏水力。Alrosan等[15]在研究小扁豆蛋白和WPI之间的相互作用时也发现静电力占主导地位。因此,PKP和WPC的复合主要受静电相互作用的影响,有氢键和疏水相互作用的辅助,但影响程度较小。当PKP与WPC反应的pH值降低时,PKP与WPC之间形成静电相互作用、氢键和疏水相互作用,控制PKP与WPC之间的相互作用。因此,这些分子力可能有利于PKP-WPC复合蛋白的形成。

2.3.2紫外-可见光谱分析结果

紫外-可见光谱对蛋白质构象很敏感。蛋白质构象折叠与230 nm处的吸光度有关,折叠的构象在230 nm处的吸光度比未折叠的构象要强[31],蛋白质的紫外-可见光谱结果见图4。

图4 蛋白样品的紫外-可见光谱Fig.4 UV-Vis spectra and secondary structure of protein samples

由图4(a)可知,复合蛋白的A230显著低于PKP,说明复合蛋白中含有未折叠的蛋白基团,其抗折叠能力强。PKP-WPC复合蛋白的pH值降低导致A230的增加[图4(b)],这证明了蛋白质的重新折叠,Wang等[16]在研究WPI与水稻蛋白相互作用时也发现:酸化使A230显著增长,蛋白质发生了重折叠。在pH值降低的过程中,复合蛋白在约230 nm处吸光度明显增长,当pH值从8.0降至7.0时,增长幅度最大。这可能是因为在此pH范围内的蛋白质经历了最大限度的复性。添加WPC使PKP更耐复性。这些发现表明,碱性环境中的PKP-WPC复合蛋白对中和过程中的结构变化具有显著的抵抗力[15]。

2.3.3圆二色谱分析结果

圆二色(circular dichroism,CD)谱能够反映蛋白质二级结构的有关信息,结果见图5。由图5 (a)可知,所有蛋白样品的CD光谱在 200～260 nm 都有较宽的负带,表明具有复杂的二级结构。与PKP相比,复合蛋白的强度显著降低,表明蛋白质的二级结构发生了明显变化,2种蛋白并不是简单地混合。类似地,正如He等[9]报导,所有蛋白样品在pH 值为7.0时,在200～240 nm都有宽的负谱带,表明具有复杂的二级结构。蛋白样品之间存在显著差异,由图5 (c)可看到,与单一蛋白相比,复合蛋白的α-螺旋、β-转角和无规卷曲结构含量增加,β-折叠含量降低,与黎露露[32]研究的大米蛋白-豌豆蛋白的二级结构含量变化一致。说明蛋白分子的刚性结构减弱,柔性结构增强,分子由有序结构变为无序,这也是蛋白质功能特性改善的原因之一。由图5 (b)可知,酸化过程中,极值的强度减小,并伴有红移,说明在pH 值为12.0时,由于结构展开暴露出更多的带电基团,蛋白内部基团间的强烈排斥作用使蛋白质膨胀和延伸,故能在碱性条件下形成稳定的结构。在中和的过程中,蛋白质会由于表面电荷的减少而趋于聚集,但是,WPC的加入会抑制PKP的折叠能力,从而起到抑制蛋白质聚集的效果,因此在中性条件下也能形成稳定结构[21]。总之,络合不是通过在PKP表面涂覆WPC开始的,而是由于协同结构相互作用,即PKP和WPC的结构可能通过肽链或二级结构而不是三级或更高结构的络合进行相互作用。

2.4 复合蛋白表面性质分析结果

表面疏水性和表面电荷对维持蛋白质溶液体系的稳定性起着重要作用。因此,对蛋白样品的表面疏水性和表面电荷进行了表征,结果见图6。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

由图6 (a)可知,添加WPC后显著降低了PKP的表面疏水性,复合蛋白的表面疏水性在酸化过程中逐渐增强 [图6 (b)],并在pH值为 7.0时达到顶峰,但显著低于PKP的表面疏水性(P<0.05)。复合蛋白的疏水性随着pH值的降低而增加,这是蛋白质复性的另一个证据。在这方面,疏水性增加的主要原因不是疏水基团增加,而是共折叠的蛋白质链使非极性基团聚集在一起,从而形成疏水区域被ANS检测到[33]。

由图6(c)可知,复合蛋白的ζ-电位的绝对值是34.74 mV,显著高于PKP和WPC的12.31和 24.43 mV。添加WPC后,表面疏水性降低,而ζ-电位绝对值增加,表明水稳定性提高。由图6(d)可看到,在酸化过程中,ζ-电位绝对值略有降低,但都显著高于单一蛋白。这表明大多数带电基团很好地保持在复合蛋白的表面。该结果与Alrosan等[15]研究小扁豆蛋白与WPI复合后表面电荷的变化趋势相同。在pH值为12.0时,蛋白质具有最高的表面电荷,说明在碱性环境中蛋白质结构展开并大量暴露于带电基团的溶剂中,产生了足够的静电排斥,从而增强了复合蛋白的稳定性,并使其在络合后溶解在水中时抵抗聚集。ζ-电位分析和表面疏水性分析再次揭示了复合蛋白的抗折叠结构,并解释了WPC添加后导致PKP溶解度增加的原因。

2.5 乳液性质分析结果

2.5.1乳液平均粒径分析结果

平均粒径是评价乳液稳定性的重要因素,液滴粒径越小,乳析速度越慢,乳液越稳定[34]。不同乳液样品的平均粒径见图7。由图7可知,PKP-WPC复合乳液的平均粒径显著低于PKP乳液。这可能是由于两种蛋白发生相互作用,蛋白的构象重排,能够快速吸附到油滴表面,降低油水界面张力,乳液稳定性提高。PKP乳液在油相体积分数为10%时平均粒径最小,为225.14 nm。在固定的蛋白浓度下,当油相体积分数从3%增加到50%时,可用于稳定界面的蛋白质颗粒减少,因此会形成大液滴。WPC乳液和PKP-WPC复合乳液随着油相体积分数的增加,平均粒径逐渐增大,含油量过高导致蛋白质不足以稳定在所有油滴表面,使乳液液滴发生了聚结。这一结果与Li等[35]研究油相体积分数对细菌纤维素纳米纤维乳液的液滴大小的影响结果一致。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

2.5.2乳液ζ-电位分析结果

ζ-电位在一定程度上可以反映乳液液滴之间相互作用的强度。ζ-电位的绝对值越大,说明液滴间斥力越大,可避免液滴聚结变大,体系越稳定[36],结果见图8。由图8可知,在所有的油相体积分数下,WPC乳液的ζ-电位绝对值最大,在油相体积分数为3%时,WPC乳液的ζ-电位值为-44.46 mV,说明此时液滴之间的静电斥力大,乳液较稳定。PKP-WPC复合乳液的ζ-电位绝对值显著高于PKP乳液,这可能是由于带负电的PKP和WPC之间的静电排斥作用抑制了液滴的絮凝,PKP和WPC的共同吸附可能导致净电荷增加,因为它们都带负电[37]。李良等[17]在研究大豆分离蛋白-乳清分离蛋白对O/W型乳液稳定性的影响时也发现复合乳液液滴表面均带有负电荷,且ζ-电位绝对值显著高于单一蛋白乳液。PKP乳液在油相体积分数为10%时ζ-电位绝对值最大,说明此时乳液最稳定。在WPC乳液和PKP-WPC复合乳液中,ζ-电位绝对值随着油相体积分数的增加而减小。3%时的乳液较稳定,这与平均粒径的结果一致。

不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)。

2.5.3乳液乳层析指数分析结果

储存10 d期间乳液的乳层析指数分析结果与乳液的外观图见图9。由图9(a)可知,复合乳液的乳层析指数显著低于PKP乳液,说明复合蛋白制备的乳液较稳定。由图9(b)可看到,刚制备(第0天)的乳液均表现出均匀的外观,含油量为50%的乳液,在第1天就发生了明显的乳析现象。在第3天时,含油量为3%和10%的3种蛋白乳液都没有发生明显的乳析现象。储存7 d后,才出现明显的乳析现象,乳层析指数显著升高。储存10 d后,WPC-3和PKP-WPC-3没有明显的乳脂化,但仍然可以观察到乳液底部的混浊程度降低。且随着储存时间的增长,乳层析指数逐渐增加。PKP乳液在储存10 d后明显观察到有油滴析出,WPC乳液和PKP-WPC复合乳液未观察到有油滴析出。PKP-WPC-3的乳液乳层析指数较低,说明乳液稳定性较好。

图9 不同乳液样品的乳层析指数及乳液外观Fig.9 Creaming index and appearance of different emulsion samples

2.5.4乳液微观结构的分析结果

激光共聚焦显微镜通常用于分析乳液的微观结构,它可以从本质上反映乳液粒子的粒径分布、分散性和稳定性[18],乳液的微观形态结构见图10。由图10可知,红色和绿色区域分别代表油滴和蛋白质。油相呈球形,表明油滴完全被乳液中的水包裹。乳液液滴的微观结构因蛋白种类和油相体积分数的不同而有很大差异。对于PKP乳液,PKP-10的液滴分布较均匀,PKP-3发生了颗粒堆积效应,这可能是由于在较低的油相体积分数下,高剪切乳化后,更多的未被吸附的蛋白质会相互结合形成聚集体。PKP-50的液滴较大,且不均匀,表明此时液滴大量聚集,乳液稳定性低。WPC乳液和PKP-WPC复合乳液的微观结构基本相似,随着油相体积分数的增加,液滴逐渐增大,且变得聚集。WPC-3和PKP-WPC-3的乳液液滴小,分布均匀且有序,说明乳液稳定性好。含油量为50%的乳液液滴变大,可观察到液滴絮凝。王一丹[38]在研究芝麻蛋白乳液性质时也发现液滴大小与油相体积分数呈正相关,且液滴尺寸增大,液滴间的聚集越明显。与PKP乳液相比,添加WPC后复合乳液液滴尺寸明显减小,且分散性好,这可能是由于复合蛋白浓度适宜且添加WPC后在油-水界面形成更加致密的膜结构。这与李良等[17]对大豆分离蛋白-乳清分离蛋白复合乳液的微观形态的研究结果相类似。PKP-WPC-3乳液结构均一、稳定。以上现象证实了测定的平均粒径、ζ-电位和乳层析指数的结果。

图10 不同乳液样品的微观形态Fig.10 Microscopic morphology of different emulsion samples

3 结 论

采用pH循环法成功制备了可溶性PKP-WPC复合蛋白。PKP与WPC相互作用改变了PKP的结构和功能特性。蛋白质的二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲),由于蛋白质络合而发生显著变化。静电相互作用、疏水相互作用和氢键有利于PKP-WPC复合蛋白的形成。在酸化过程中,两种蛋白质之间的相互作用抑制了蛋白质的结构复性,并维持了蛋白质的带电表面,从而显著提高了PKP的溶解度。PKP-WPC复合乳液显示出较好的乳液稳定性,PKP-WPC-3乳液的稳定性显著高于PKP-WPC-10和PKP-WPC-50,乳液的平均粒径、ζ-电位、乳层析指数分析以及显微镜观察证明了这一点。研究结果可为新型蛋白产品的研发提供理论基础,有助于拓宽松仁蛋白在加工食品中的应用范围。